许琳;张伟强;陈来成;陈宇宇;温文忠;胡建强
【摘 要】通过松茸提取液清除羟基自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基以及抑制非酶糖基化反应实验,研究了松茸提取液在抗皮肤衰老方面的功效.研究结果表明,松茸提取液对羟基自由基、DPPH自由基和非酶糖基化反应均有很好的清除或抑制作用,且与其含量密切相关.当松茸提取液体积分数为4.0％时,对羟基自由基的清除率为89.6％;当松茸提取液的体积分数为25.0％时,对DPPH自由基的清除率达到96.4％;当松茸提取液的体积分数为20.0％时,经过14 d培养后,对非酶糖基化反应抑制率可达到91.5％. 【期刊名称】《日用化学工业》
【年(卷),期】绿体育2015(045)002
【总页数】4页(P103-106)
【关键词】抗衰老;松茸提取液;自由基;非酶糖基化反应
【作 者】许琳;张伟强;陈来成;陈宇宇;温文忠;胡建强
【作者单位】华南理工大学化学与化工学院应用化学系,广东 广州510640;华南理工大学化学与化工学院应用化学系,广东 广州510640;广州市尊爱日用化妆品有限公司,广东 广州510800;华南理工大学化学与化工学院应用化学系,广东 广州510640;青蛙王子(中国)日化有限公司,福建漳州363000;华南理工大学化学与化工学院应用化学系,广东 广州510640
【正文语种】中 文
【中图分类】TQ658
随着社会进步和人们生活水平的提高，人体皮肤泽方面的问题引起了人们和化妆品科研人员的广泛关注[1-3]。皮肤是人体最大的器官，皮肤的泽直接反映皮肤的健康程度，与个人的容颜面貌密切相关。而导致皮肤出现衰老产生泽问题的主要原因是皮肤中含有过量的自由基和人体内的非酶糖基化反应。
具有极强氧化能力的自由基能使生物膜中的不饱和脂类发生过氧化反应，产生过氧化脂质(LPO)，其最终产物丙二醛(MDA)易将蛋白质和核酸等交联成难溶性的物质，使生物膜硬化
并导致其通透性降低，影响细胞物质的交换等。自由基性质活泼且容易与其他物质发生反应生成新的自由基，因而往往都有连锁反应。过量的自由基会引起机体损伤、不饱和脂肪酸过氧化，产生羰基化合物，进而与蛋白质等生物大分子交联，形成脂褐素[4]。不过，低浓度适量的自由基是人体生命活动必需的，它可以促进细胞增殖，刺激白细胞和吞噬细胞杀灭细菌，消除炎症，分解毒物。
非酶糖基化反应是人体内与能量代谢相关的生物化学副反应之一，是不需要氧参与的生物化学副反应[5]。糖是一种多羟基的醛酮，它与蛋白质或氨基酸发生的第一步反应是羰-氨反应，而蛋白质的进一步交联反应也属于羰-氨反应。所以氧自由基损伤、非酶糖基化损伤及其他氧化伤害的本质都是羰基毒化作用。羰基毒化包括氧化反应和非氧化反应中所有羰基的反应，产生的羰基类毒素则会影响人类的健康。
自由基和非酶糖基化反应是产生羰基化合物(DMCs)，并产生脂褐素类物质，最后形成素异常和斑的主要诱因。因此清除人体肌肤中过量的自由基和非酶糖基化反应，减少对肌肤的伤害成为目前解决皮肤泽问题的一个主要途径。作为口蘑科真菌松口蘑子实体的松茸，其主要成分包括多糖、甾体、皂苷、蒽醌类、酚类、鞣质、生物碱、香豆素、萜类酯
化合物、油脂、三萜、甾醇、8种必需氨基酸和维生素等[6]。刘金庆等[7]通过实验证明松茸提取物能够延长果蝇的寿命。张娅等[8]的研究表明，松茸多糖提取物具有抗氧化作用。笔者通过松茸提取液清除羟基自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基以及抑制非酶糖基化反应实验，研究松茸提取液在抗皮肤衰老方面的功效，以期为其在药品、保健品和化妆品的研发和应用上提供参考。
铬污染1.1 材料、试剂与仪器
进口松茸提取液，广州久恒有限公司。30% H2O2、水杨酸、FeSO4·7H2O、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、无水乙醇、二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠、葡萄糖、牛血清白蛋白和叠氮化钠(NaN3)，广东光华化学试剂有限公司。上述所有试剂都是分析纯，且使用前未进行任何提纯。实验过程中所使用的水均为超纯水(>18 MΩ·cm)；所有的玻璃仪器在使用前均先用王水润洗，然后用超纯水冲洗干净。U3010紫外可见分光光度计、F-4500荧光分光光度计，日本日立公司。
1.2 测试方法
1.2.1 松茸提取液对羟基自由基的清除实验
取13支试管，分别向每只试管中依次加入2 mL 1.8 mmol/L的FeSO4溶液、不同量的1.8 mmol/L的水杨酸溶液和蒸馏水以及0.1 mL 0.03%的H2O2溶液，计时，并将所有试管置于37 ℃水浴中保温，10 min后分别向各试管中加入不同量的松茸提取液，使各试管中溶液总体积均为5 mL，溶液组成见表1。将所有试管继续于37 ℃水浴中保温20 min，然后用紫外可见分光光度计在528 nm波长下测定各试样的吸光度。测定时，以第13号试管中的试样为标准对照，其他试管中加入等量松茸提取液的试样为一组，其中双号试管中的试样为底对照，单号试管中的试样为待测样。
羟基自由基清除率按下式进行计算：德国马哈
清除率=(1-A/A0)×100%
式中A和A0分别是加入松茸提取液的待测样扣除底对照后的吸光度值和不加松茸提取液的标准对照的吸光度值。
1.2.2 松茸提取液对DPPH自由基的清除实验
取5支试管，分别向每只试管中加入2 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，并将试管避光置于冰
水浴中，再依次分别加入不同量的50%松茸乙醇溶液和无水乙醇，使各试管中溶液总体积均为4 mL，溶液组成见表2。避光反应30 min后，以无水乙醇为参比，用紫外可见分光光度计测各试样在517 nm处的吸光度。
DPPH自由基清除率按下式计算：
清除率=(1-A/A0)×100%
式中A和A0分别是加入松茸提取液后试样的吸光度值和不加松茸提取液的DPPH标准对照试样的吸光度值。
1.2.3 松茸提取液对非酶糖基化反应的抑制实验
向100 mL pH=7.4的0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液中加入19.82 g葡萄糖，0.402 4 g牛血清白蛋白和0.39 g叠氮化钠，混匀后即形成反应液。取6支试管，分别向每支试管中依次加入4 mL反应液、不同量的松茸提取液和蒸馏水，使所有试管中溶液总体积均为5 mL，溶液组成见表3。用荧光分光光度计测定所有试样的初始荧光值，然后将所有试管置于37 ℃水浴中避光保存7 d，再测定各试管中试样的荧光值，继续将所有试管在37 ℃水浴中避光保存7 d后
测定荧光值。测试条件为：激发波长370 nm，狭缝5 nm；发射波长范围380～500 nm，狭缝5 nm；光源电压700 V。
非酶糖基化反应抑制率按下式进行计算：
抑制率=[1-(A′-A)/(A0′-A0)]×100%
式中A′是加入松茸提取液的试样培养了一段时间后的荧光发射值；A是加入松茸提取液的试样的初始荧光发射值；A0′是无松茸提取液的试样培养了一段时间后的荧光发射值；A0是无松茸提取液的试样的初始荧光发射值。
2.1 松茸提取液含量对羟基自由基清除率的影响
不同含量的松茸提取液对羟基自由基的清除率如图1所示。从图1中可以看出，随着松茸提取液含量的增加，羟基自由基的清除率逐渐增加。当松茸提取液的体积分数为0.2%时，其羟基自由基的清除率为47.0%；当松茸提取液的体积分数为4.0%时，其羟基自由基的清除率为89.6%。从图1中还可以看出，当松茸提取液的体积分数从0.2%增加到2.0%，其羟基自由基的清除率快速增加，但当松茸提取液的体积分数大于2.0%后，增速趋缓。
图1表明，松茸提取液对羟基自由基有显著的清除功效，而且其清除效果与含量呈正相关。松茸提取液能清除羟基自由基可能是因为其含有大量维生素类物质，维生素如维生素A，C和E等都具有良好的清除自由基的效果[9]。如维生素E能在自由基起作用前与之结合，消除其危害，对机体起保护作用。而维生素C存在还原型抗坏血酸和氧化型脱氢抗坏血酸2种形式，可通过逐级供给电子转变成半脱氢抗坏血酸和脱氢抗坏血酸，在转化的过程中起到清除自由基的作用。
2.2 松茸提取液含量对DPPH自由基清除率的影响
不同含量的松茸提取液对DPPH自由基的清除率如图2所示。
从图2中可以看出，随着松茸提取液含量的增加，DPPH自由基的清除率也逐渐增加，并且几乎呈线性关系。当松茸提取液的体积分数为6.3%时，其DPPH自由基的清除率为38.0%；当松茸提取液的体积分数为25.0%时，其DPPH自由基的清除率达到96.4%。
图2表明，松茸提取液对DPPH自由基具有良好的清除功效，并且其清除效果与松茸提取液的含量呈正相关。松茸提取液能清除DPPH自由基可能是因为其含有维生素C，而维生素C
在清除DPPH自由基中起着非常重要的作用。DPPH在溶液中以DPPH自由基和具有高度共轭结构的DPPH+形式存在。维生素C对DPPH自由基的清除机理主要包括以下2个方面：通过还原作用把电子和质子传递给DPPH自由基氮原子上的单电子从而生成DPPH2；维生素C和DPPH+发生氧化还原反应使其分解生成三硝基苯胺或生成异氰酸酯产物[10]。
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