一氧化氮合成酶（NOS）基因表达的半定量
检测及其运用
一时性起
4
生理,1994,4B(4),347354
ActaPhysiologicaSinica
一
氧化氮合成酶(NOS)基因表达的
半定量检测及其运用
1
张晨晖李肯虹，继峰周洪张新波场健
r_元j五吾础研究所分子生物学研究室北京I.口舶3)
-
三
Jl摘要'
/4
'本工作参照Mi~lin(1993)定量RTPeR方法，建立了一种灵敏，简捷，特异的定量NOS
mRNA测定方法}证明了NOSmRNA不仅存在于脑组织，亦广泛分布于心，肾，肺和肝组织中,
其中以脑组织含量最高，肾，心次之.除内皮细胞以外，平滑肌细胞中亦有NOS基因的表达}此
外，本工作还观察到，自发性高血压大鼠的脑，肾，肝和平精肌细胞中NOSmRNA水平下降，提 示NOS基因表达受抑，可能与高血压的病国密切相关.
f上一,
关键词:
.
苄基三乙基溴化铵
=墨些窒盛堕差里室垄自发性高血压太最；半定量pcRzfl兰,-
近年来的研究证明，一氧化氮(nitricoxide,NO)是一种血管内皮细胞释放的内皮衍化舒张因子(endothelium—delvedrelaxingfactors,EDRFs)，它具有舒张血管，降低血压，抑 制血管平滑肌细胞增殖和血小板粘附等重要的生理作用，在高血压，心肌缺血等许多心血
管疾病的发病中具有重要意义.NO是由L广精氨酸(L—ARG)和分子氧在一氧化氮合成
酶(nitricoxidesynthase,NOS)催化下合成的,NOS则是NO生成的关键酶.最近,NOS cDNA已经在大鼠内皮细胞，小脑中克隆出来0一:.但是关于它在体内不同组织的分布以及
在心血管疾病高血压发病中的作用，迄今还未见报道.本工作应用聚合酶链式反应(po]y— merasechainreaction,PCR)技术建立了一种新的，简捷，特异的定量NOSmRNA的测定
方法，研究了NOS在大鼠体内的分布，发现自发性高血压大鼠(spontaneoushyl~rtenslverat,
SHR)脑，肾和肝中NOSmRNA的表达明显降低，其内皮依赖性的血管舒张反应亦明显下
降提示,N0S基因表达下降，可能与高血压的病因密切相关.
1材料和方法
动物本工作选用8—1o周龄的雄性SHR和WKY(Wistar-Kyotorat,WKY)大鼠
进行实验,SHR大鼠由Okamoto等选育成功，其特点为1oo%高血压自发率(BP=22.7士
1.3kPa)，同时具有高血压性心血管病变，适用于人类高血压病的研究,WKY为其正常对照模型，实验所用动物由中国医学科学院心血管研究中心提供
车文19日3年6月8日收到1993年9月12日修回
生理46卷
试剂本工作所用的反转录酶(MoMLV)和TaqDNA聚台酶分别购自美国的Stret- gene公司和Perkin—Klmer公司,[P]dCTP为北京福瑞公司产品(放射比活度为3O00Ci/
mmo1)RandomPrimer和dNTP购自美国Promega公司，其它试剂均购自美国Sigma 公司.
细胞培养取用6—8周龄雄性SHR,WKY大鼠和新生小牛的胸主动脉段，分别按Hofman和Booyse的方法培养血管平滑肌细胞和内皮细胞.本实验选用5—8代细胞进行
实验.
带锯条焊接总RNA的制备取10的平滑肌细胞或内皮细胞，用RNAzolBRNA提取试剂盒(美国TEL—TEST公司)提取细胞总RNA.各取1g脑，心，肺，肾，肝组织采用异硫氰酸胍
一
酚一氯仿方法：提取组织总RNA.总RNA提取完成后，分别用紫外分光光度计测定总RNA
的浓度，重复测定三次.oD:OD.比值在1.8—2.0之间.计算样品总RNA的浓度.
反转录(reversetranscription,RT)取2lag总RNA，在65℃变性3min，依次加
入0.5mmol/LdNTP,0.01mol/LDTT,10pmol/LRandomPr/mer,15unit反转录酶和oH 8.350mmot/LTris—HCI,75mmol/LKCI,3mmol/LM鲁cl2缓冲液，总反应体积为201.在
37℃保温90min.反应结束后，加入50TE缓冲液(pH8.010mmol/LTris—HCI,1mmol/ LEDTA)，于70℃加热10min以终止反应
吴少芳定量PCRNOS寡核苷酸的引物合成是根据Bredt等E3]发表的大鼠小脑NoscD- NA序列应用DNA合成仪合成的.引物A,B序列分别为:
5GG:GAATCCATACCAGCCTGATCCATGGAACC3
5TACTCGAAACGCCTGAA TGG3
用这一对引物可以扩增出自2463bp-3124bp(661bp)的NOScDNA序列，长度相当于
821aa一1041aaNOS氨基酸序列.
阎仲川取1/lo体积(71)反转录反应液，分别加入200mmol/LdNTP,50pmol/LNOS寡核
苷酸引物,0.5ttCi32P]dCTP和pH8.310mmol/LTr/s—HCI.50mmol/LKC1,1.5mmol/ LMsCl缓冲液,2.5unitTaqDNA聚合酶；总反应体积为100l.最后加入50山轻矿物油.
PCR反应所需的变性，退火和延伸温度分别为:94℃,55℃和72℃，反应时间分别为:1
调度指挥系统
,2和3min.共进行25—35次循环.首次循环.94℃需要3min.反应完成后取10山PCR
反应物进行1.5琼脂糖凝胶电泳(含0.5~tg/ml的溴化乙锭)分析，以0xl74/HaeⅢ为分子量标准，电泳缓冲液为1xTBE(0.09mol/LTris一硼酸,0.002mol/LEDTApH8.0). 电泳完毕后在紫外灯下照片，并切取含有荧光条带的凝胶，应用液体闪烁计数仪进行放射
性测量.
2实验结果
2.1NosmRNA刹量方法的建立
本工作依据Martin(1993)的方法建立了定量NOSmRNA测量方法.其结果如图1. 2所示.由图1可以看出，脑组织总RNA反转录后经25—35次PCR扩增后，其NOScDNA
片段约为660bp与所设计的NOScDNA相同.其扩增量与扩增循环次数密切相关.由图
2可以看出，脑组织总RNA样本量不同,RT—PCR后NOScDNA产率亦不同.具有明显的
4期氧化氮合成酶(Nos)基因表达的半定量捡涮及其运用349
剂量一效应关系；应用0.25ug的总RNA，即可检测到NOSmRNA
圉1PCR扩增产率与循环次数之间的剂量
一
效应关系
.1Dose—effectrelationshipbetwec"
theyieldofPCRproductandthe
numberofPCRampJificationcy
cle
(n一3,:K2:SE).M:xl74/Ha~I
l000
Am0u"【ofIOtillRNA
2530
圉2PCR产量和总P,NA量之间的剂量一效
应关系
Fig.2D.se—effectrelationshipbetwoen
theyieldofPCRproductandthe
amountoftotalRNA
n一3，士SE.
0,l?2,3,4tamountoftOtalRNA
(0,0t25,0.5,1.0,1.5.2,respec-
tire竹).
MI.xl74I/HaeI.
…
取浓度脑组织总RNA(2g)，分别经过5RT—PCR后.
NOScDNA产率基本
相同?具有良好的重复性.结果见图3所示.
圈32恒量总RNART-PCR重复实验
Fjg?3RT-PCRrepeatexperimentwithaconstant~Jnount.ftotalRNA(2ug)
l,2,3-4,5:RT—PCRrepeattimes
M：似174/Ha~I.
2?2N0SmRNA在大鼠体内分布
取正常Wistar大鼠小脑，心，肺，肾，肝组织，提取总RNA，应用RT-PC~，测定不同组织中NOSmRNA的分布，其总RNA用量均为2.
0ug，其结果如图4所示.由图可l}{
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