邓 玮，陈庆伟，李兴升，李桂琼，柯大智，莫显刚
【摘 要】【摘要】 目的 建立缺血性心肌纤维化小鼠模型并探讨其胶原沉积机制。方法 将BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组，每组10只。实验组予以腹部皮下注射异丙肾上腺素50 mg/kg，每天2次，连续10 d。对照组同法注射生理盐水。对比体表心电图，45 d后处死小鼠，天狼猩红染观察心脏I、III型胶原纤维含量，荧光定量PCR检测心脏基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)基因表达，免疫组化染分析心、肝、肾组织层粘连蛋白(LN)的表达。结果 实验组小鼠室性心律失常增多，心率加快(P＜0.05);心脏胶原沉积较多，MMP-9、TIMP-1、LN表达上调(P＜0.05)，肝、肾组织 LN无明显改变(P＞0.05)。结论 异丙肾上腺素能制备缺血性心肌纤维化小鼠模型，其机制与MMP-TIMP失衡有关。 【期刊名称】细胞外基质中国实验动物学报
【年(卷),期】2011(019)002
【总页数】5
【关键词】【关键词】 异丙肾上腺素;心肌纤维化;小鼠;动物模型深圳书城培训中心
动物模型的稳定性、高仿性和易操作性是心血管疾病研究的首要考虑因素。建立一种简便易行的心肌纤维化动物模型，对于研究心肌纤维化病理生理进程及干预有着重要的意义。异丙肾上腺素造模方法接近疾病进程，且相对无创、动物死亡率低，但目前文献报道的注射剂量不一，尚无心脏胶原沉积及其病理机制报道。本实验采用异丙肾上腺素腹部皮下注射法制备缺血性心肌纤维化小鼠模型，观察心脏胶原纤维沉积，并探讨其可能机制。
1 材料与方法
1.1 动物
BALB/c雌性SPF级小鼠20只，体重18～20 g，约6周龄，由重庆医科大学实验动物中心【SCXK(渝)2007-0001】提供。按照实验动物使用的3R原则，实验处置符合动物伦理学标准。
1.2 药物
异丙肾上腺素注射液：造模药物，上海禾丰制药有限公司生产。批准文号：国药准字 H31021344。生产批号：080701。规格：每支1 mg/2 mL。
1.3 模型制作
20只BALB/c雌性小鼠，随机分为实验组和对照组，每组10只。实验组小鼠腹部皮下注射异丙肾上腺素50 mg/kg，每天2次(间隔 12h)，连续10 d。对照组同法注射生理盐水。
日落黄1.4 体表心电图对比心率及心律
异丙肾上腺素注射后，麻醉小鼠，行体表心电图分析。采用Nihon Kohden ECG-6511单道心电图机(上海光电)接上肢体导联，记录 II导联心电图，分析心率及心律变化。
1.5 -天狼猩红染分析心脏胶原纤维含量
两组小鼠常规饲养45 d。颈椎脱臼法处死小鼠。取左心室横断面中部约2 mm厚的组织制成连续石蜡切片，厚度5 μm，并进行-天狼猩红染［1］。Image-Pro Plus图像分析软件(Media Cybernetics公司，美国)行定量分析。
1.6 实时荧光定量PCR分析心脏MMP-9、TIMP-1表达
摘取心脏，取心尖组织行实时荧光定量 PCR。Trizol一步法提取总 RNA，紫外分光光度计验证其纯度。常规方法逆转录合成cDNA。
根据GeneBank设计特异性引物。MMP-9引物(序列为：F 5′-CACAGCCAACTATGACCAGGAT-3′，R 5′-GCTGCCACCAGGAACAGG-3′)，TIMP-1 引物(序 列 为：F 5′-CCCCAGAAATCAACGAGACC-3′，R 5′-CGCCAGGGAACCAAGAAG-3′) 和 β-actin 引 物(序列为 F 5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′，R 5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3′)由上海闪晶生物科技有限公司合成。
使用FTC2000(Canada)荧光定量PCR仪进行扩增反应。采用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒(上海闪晶)分别对目的基因进行定量检测。每反应体系包括 cDNA 1μL，2 ×PCR buffer 25 μL，目的基因引物对(25 pmol/μL)0.6 μL × 2，无 RNase水 22.5 μL，Sybr green I(20 ×)0.3 μL 等; 经94℃4 min;94℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s 循环 35 次，72℃检测信号。同时检测 β-actin表达水平作为内参照，生成标准曲线、扩增曲线及熔解曲线，并读取循环阈值 (cycle threshold)，采用相对比值法进行计算。
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1.7 免疫组化分析心脏LN的表达
心、肝、肾组织按常规方法行切片免疫组化染。按过氧化物酶标记的链霉卵白素染试剂盒(北京中杉金桥)、LN抗体(北京博奥森)说明书操作，阴性对照以PBS液代替一抗。显微镜观察 LN的阳性着部位及数量，Image-Pro Plus图像分析软件(Media Cybernetics公司，美国)行定量分析。LN阳性表达量以阳性表达物的平均吸光度值(average integrated optical density)(取10个视野的平均值)来表示。
1.8 统计学分析
采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差(s)表示，组间比较采用成组t检验，P＜0.05为统计有显著意义。
2 结果
2.1 两组小鼠心率及心律比较
对照组小鼠心率为每分钟(599.20±22.48)次，实验组小鼠心率加快，为每分钟(720.50±34.
71)次，实验组与对照组相比，差异有显著性(P＜0.05)。实验组小鼠室性心律失常明显增加，可见室性早搏、室性颤动等(图1)，偶见房室传导阻滞。
2.2 心肌胶原纤维分布
在普通光镜下，Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维呈红，心肌细胞呈黄(图2-A)。在偏振光显微镜下，I型胶原纤维呈明亮的橙红或明黄;III型胶原纤维呈绿。图像定量分析结果(图2-B)显示，实验组的胶原纤维沉积较多，对照组的胶原纤维含量较少(P＜0.05)。图2见彩插4。
2.3 心肌 MMP-9、TIMP-1 mRNA表达
实时荧光定量PCR结果显示：与对照组相比，实验组心肌的 MMP-9和 TIMP-1表达明显增高(P＜0.05)，见图 3。
2.4 各组心、肝、肾LN的表达
与对照组相比，实验组心肌LN表达较多(P＜0.05)，主要表达于胶原纤维沉积区和心肌细胞边缘，见图4。两组小鼠肝(图5)、肾(图6)组织的LN表达差异无显著性(P＞0.05)。图4～6见彩插4。
3 讨论
随着心血管疾病及研究的不断深入，稳定高仿的缺血性心肌纤维化动物模型是实验成功的基础。结扎冠脉［2］、缩窄腹主动脉、夹闭肾动脉等方法均为开放性手术造模，创伤大，对动物模型后续的基因或干细胞不利。为探寻接近心肌纤维化病理进程的小鼠模型，我们开展了此项研究。
姚刚与李继红本实验通过前期预实验和本研究发现，异丙肾上腺素50 mg/kg行腹部皮下注射，每天2次，连续10d，能制成明显的心肌纤维化小鼠模型。此缺血性心肌纤维化小鼠模型心率加快，室性心律失常增加，心脏Ⅰ、Ⅲ型胶原大量沉积，LN增多，其机制与MMP-TIMP表达失衡有关。
异丙肾上腺素是β受体激动剂，作用于心脏β1受体，使心收缩力增强，心率加快，心输出量和心肌耗氧量增加。我们参考了异丙肾上腺素制模的相关文献［3-5］，并在预实验中摸索了注射剂量、间隔时间及给药时程，发现50 mg/kg行腹部皮下注射，每天2次，连续10天是小鼠不致死又快速损伤心肌的较好方法。
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心肌纤维化的本质是心脏细胞外基质重塑。细胞外基质最主要的成分是Ⅰ、Ⅲ型胶原，此外，LN、弹性蛋白等也参与其中［6］。研究结果显示，实验组心脏胶原纤维增生、LN较多，证明缺血性心肌纤维化造模成功。异丙肾上腺素注射后，小鼠心肌耗氧量持续增加，通过血流动力学效应［7］和神经体液因素［8］影响，心脏基质重塑的关键酶 MMP及 TIMP表达失衡，是造成心脏Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维增生的主要原因［9，10］。本研究中，实验组心脏 MMP-9和 TIMP-1表达明显上调，提示异丙肾上腺素注射可导致心脏MMP-TIMP系统紊乱。MMP-TIMP与心脏胶原沉积有着密切关系。MMP-TIMP表达紊乱直接导致胶原纤维合成增多、降解减少［11，12］。
MMP-TIMP 上调还影响 LN 表达增多［13，14］。实验组的心脏间质 LN表达增多，而肝、肾组织LN表达无明显改变，提示异丙肾上腺素注射能特异性地损伤心肌。
本缺血性心肌纤维化小鼠模型的优越性在于：不进行开腹、开胸手术，降低了动物死亡率;制模方法简单，符合缺血性心肌损伤的病理进程，是心血管动物实验的较理想动物模型。
(本文图 2，4 ～6 见彩插 4。)
参考文献
［1］ Whittaker P，Kloner RA，Boughner DR，et al.Quantitative assessment of myocardial collagen with picrosirius red staining and circularly polarized light［J］.Basic Res Cardiol，1994，89(5)：397-410.
［2］ 李金轶，钟国强，韦卓，等.大鼠心肌梗死模型的建立及梗死后心电生理和左室功能的变化［J］.中国实验动物学报，2009;17(6)：419-423，I0003，I0004.
［3］ Brooks WW，Conrad CH.Isoproterenol-induced myocardial injury and diastolic dysfunction in mice：structural and functional correlates［J］.Comp Med，2009，59(4)：339-343.
［4 ］ Sun Y，Weber KT.Animal models of cardiac fibrosis［J］.Methods Mol Med，2005，117：273-290.
［5］ Arteaga de Murphy C，Ferro-Flores G，Villanueva-Sanchez O，et al.99mTc-glucarate for detection of isoproterenol-induced myocardial infarction in rats［J］.Int J Pharm，2002;233(1-2)：29-34.
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