细胞内双反应物递送的聚乙二醇-聚（二硫氨基甲酸酯胺）嵌段共聚物的自组装胶束 在酸性和还原反应中PEG-SSPCA胶束的不稳定特性
作为一个例子，通过跟踪他们的大小的变化，研究酸或还原条件对PEG–ssbap胶束的影响。在室温下PEG–SSPCA胶束粉末溶于磷酸盐缓冲液（pH 7.4、pH 6.5、pH 5.5、20 mM）在DTT 的存在或不存在（0.5mM）培养12小时。利用动态光散射测量大小。
装载DOX PEG–SSPCA胶束通过透析的方法进行。总之，阿霉素/盐酸盐（1mg）和三乙胺（10ul）溶解在DMSO（1ml）下搅拌过夜。PEG–SSPCA共聚物（10mg）也被溶解在DMSO（1ml）含三乙胺（10ul）。接下来，DOX和共聚物的溶液混合均匀，滴加去离子水（10ml）在圆底烧瓶搅拌下超过2小时。最终的步骤是去离子水（2*5L）经透析（10k MWCO）。残留的溶液通过膜过滤（0.45um，微孔）和最终在冷冻干燥后得到一个红的粉末。载药量（DLC）和载药效率（DLE）分别用下列方程计算：DLC=（载带药物的量/药 物载带胶束的量）*100%，DLE=（载带的药物的量/投加的药物总量）*100%。
阿霉素在肿瘤细胞中的转运
细胞内阿霉素载带胶束转运是在Z-Stack扫描模式用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察。简而言之，MCF-7或者SKOV-3种在玻璃的24孔板上密度控制在5*10^4，在37度和潮湿的5%CO2环境中孵化24小时。阿霉素载带PEG-SSBAP胶束在培养基中与细胞一起孵化。在1,4,24小时，利用干净的PBS缓冲液来清洗细胞，和干净的冷丙酮混合，用DAPI（1%）染10分钟，在红细胞荧光成像在CLSMZ-Stack扫描模式可以看见。
PEG-SSBAP胶束的抗癌效果乌鲁克
通过HepG2，SKOV-3，MCF-7等癌细胞来对阿霉素载带PEG-SSBAP胶束的抗癌活性进行评估。细胞（个数10000）和胶束在96孔板上加入阿霉素的浓度在0.001-10ug/ml的培养基孵化24小时。根据操作说明利用阿尔玛蓝在检测细胞活性。未经处理的细胞（空白组）的存活率为100%。在相同的浓度下Dox单独的抗癌活性被设置为控制组。不同浓度（5-400ug/ml）的PEG–ssbap共聚物的毒性进行了检测，对细胞和PEG-SSBAP在培养基中共
同孵化24小时后的细胞毒性。同时，对PEG–ssbap降解产物，即BAP和半胱胺，使用相同的方法测试毒性汉字与中国心
动物实验etrust
结论
PEG–聚（氨基甲酸酯胺）嵌段共聚物的合成和表征
在这项工作中，一系列新的PEG–聚（二硫氨基甲酸胺）（记为PEG–SSPCA）的嵌段共聚物通过2,2’-二硫乙二醇-双（对硝基苯基碳酸酯）（DTDE-PNC）和氨基封端的PEG的混合物（PEG-NH 2）和一个含叔胺伯二胺聚合反应，然后用过量二元胺终止反应。三个二元胺通过各种方式被应用于PEG-SSPCA胶束在聚（氨基甲酸酯）块。（图1）粗产物完全溶解在酸性水溶液（pH = 5）和通过超滤过程纯化，以消除低分子量的聚合物和非共轭的聚乙二醇。冷冻干燥后，得到作为盐酸盐的形式的三个共聚物。在DMF和水溶性测试中显示这些共聚物被溶解，测试浓度是1mg/ml.核磁共振谱分析表明，PEG–SSPCA共聚物的化学成分均与预期一致（图S1），从光谱图上，δ7.3和δ8.3处的信号在对硝基苯残留的芳
香质子，不能被检测到，表明PEG–SSPCA共聚物由伯胺端基和对硝基苯残留应在终止反应完全消耗。PEG –ssbap的红外分析在化学位移1700厘米cm-1和1530cm-1处有两个信号峰，是在聚合物中中氨基甲酸酯键的C=O键（图S2）。GPC测试表明这些PEG–SSPCA共聚物具有单模谱峰（图S3）
在体外实验形成的PEG–SSPCA纳米胶束对于药物的载带和释放 探索PEG-SSPCA共聚物是否形成胶束，这些共聚物的溶液分别进行了动态光散射（DLS）和
透射电子显微镜（SEM）。结果发现，这些共聚物自组装在纳米颗粒的范围内形成纳米级的胶束直径范围是141-214nm（表二）。这些PEG–SSPCA胶束的尺寸分布较窄（PDI 在0.12–0.26）和单峰模式。此外，聚（氨基甲酸酯）块的结构对PEG–SSPCA颗粒粒径有一定影响。PEG–SSBAP胶束具有最小的尺寸，可能由于BAP（2,2-双(3-氨基-4-羟基苯基)丙烷）残渣的疏水性能。通过DLS分析和透射电镜下观察到的球形形貌。图2a显示了一个典型的PEG –SSBAP胶束的粒度分布的峰值。在PBS溶液中对不同浓度的PEG–SSPCA进行荧光光谱分析而且有一个芘探针提供这些共聚物的临界胶束浓度（CMC）。（图S5，表二）
，反映的PEG-SSPCA胶束疏水区。PEG–SSPCA共聚物的CMC值可以通过氨基酸残基的结构调整。PEG –SSBAP在这三种共聚物中具有最小的CMC（24.5ug/ml），因此更具有研究前景。在酸性或还原性条件下，通过检测PEG–SSBAP胶束的粒径，对PEG–SSPCA胶束响应细胞内环境的能力进行评估。在图2b中可以看出，PEG-SSBAP胶束的大小在PH7.4的PBS缓冲液中稳定12个小时。然而，当pH环境从7.4下降到6.5和5.5，胶束的大小显着增加从141nm-192nm 再到225nm，这表明PEG–ssbap胶束酸反应能力。另外，在延长培养时间从12小时增加到24小时，胶束的大小从225 nm增加到458 nm。在（氨基甲酸酯胺）单元这种酸的反应行为归因于叔胺的质子化作用。PEG-SSBAP的酸碱滴定分析进一步支持了这一点，表明了叔胺的质子化程度从44%增加到62%，而且PH值从7.4减小到5.5（图S4b）。除了酸响应特征，PEG–SSBAP胶束有还原反应谱。例如，胶束在1mmol/L的DTT（1mmol/L）硫醇模拟细胞内的还原条件）中孵化12小时，胶束的尺寸显著增强从141nm-186nm（图2C）。这种还原反应在孵化24小时后变得更加明显，会出现一个更大的尺寸1127nm。总的来说，这些结果表明，PEG–SSBAP胶束在生理条件下可以相对稳定，但在酸性、还原环境不稳定，暗示细胞可能在细胞内不稳定，有一个药物释放响应。
为了测定PEG-SSCPA胶束的药物载带，将一种抗癌药物，阿霉素，通过传统的渗析的方式封装到胶束。DLS分析揭示了Dox载带后PEG-SSCPA胶束的相比单独的PEG-SSCPA胶束出现轻微的放大（表二）。但是尺寸分散性也变大了，可能是阿霉素编入进疏水性的SSCPA单元，引起尺寸的增加。分别测试载药量（DLC）和载药率（DLE）（表二）。PEG-SSBAP表现出高的药物DOX载带能力，适中的DLC为5.7%，DLE为65.4%。此外从四个独立的批次，可以看出PEG-SSBAP的DLC为5.7+—0.5%，这是类似或高于在以前的报告中的双响应共聚物例如。。。税务总局曝光5起涉税违法案件
其次，在酸性和/或还原环境，模拟细胞内的微环境，对阿霉素从聚乙二醇–ssbap胶束负载的阿霉素释放出来进行评估。（图2d）。在一个生理环境中（PH=7.4），PEG-SSBAP胶束在72小时内可以看出一个较低的药物释放，20%的累计药物释放。但是药物释放率被提升随着PH 被调节到6.5（核内体PH）。在这种情况下，82%载带的阿霉素被释放出来在相同的时间内。当胶束在PH为5.5的环境中被孵化（溶酶体PH）。在这种情况下，药物释放率提升了。举个例子，在10小时内，PH为5.5时检测到40%的阿霉素从胶束中释放出来。但是当PH=6.5时，只有20%的阿霉素释放。药物释放率的提高可能是由于PEG-SSBAP的不稳定而且PH从6.5减小到5.5（图2b），酸性下降。进一步研究，从胶团中进行高效的药
物释放被发现是在还原情况下（0.5mMDTT），这是由于二硫化物分裂导致胶团不稳定的结果。（图2c）。值得注意的是，任一酸性或还原性条件下，发现药物释放的不足，72小时内累计DOX释放为80 %。然而，在酸性和还原性的环境，例如，pH值5.5加0.5毫摩尔每升DTT，在10 h内即可发现PEG–ss bap胶束累积DOX释放率为100 %，（图2d），表明，这样的双响应胶束能更有效的在细胞内进行完整的药物释放。
通过在CLSM在三维重建模式下测DOX发出的红荧光信号进行观察，PEG–ssbap胶束负
载阿霉素在MCF-7细胞中的细胞内分布，图三表示了胶束在细胞内1 h和24 h后的细胞内分布（只有DOX存在下作为控制组），孵育后的胶束（或DOX）与细胞。这些细胞和PEG-SSBAP 负载阿霉素一起孵化在孵化后一个小时后，细胞核和细胞质内有红荧光信号。（图3c），这些不同可能归因于PEG-SSBAP负载的DOX由于它们几乎中性的表面电荷他们会经历较慢的细胞内吞，但是单独的DOX可通过快速分子扩散进入细胞。在卵巢癌细胞中也观察到类似的现象，孵育1 h后，在PEG-SSBAP负载的DOX胶束主要存在于细胞质中而游离DOX位于细胞核内（图S6）。在胶束与细胞孵育4或24小时后，DOX在MCF-7细胞中的积累水平明显增强（图3b和c）. 此外，红荧光聚集在细胞质中观察到的可能是由于
胶束的一部分位于内体/溶酶体.通过CLSM图像也进一步证明了这一观点，可以在溶酶体内检测到DOX的红荧光。（图S7）。因为胶束在和细胞共同孵化24小时后，释放的红荧光信号在细胞核中。（图3c和e）, PEG–ssbap胶束有传递和释放DOX进入细胞的能力。最有可能的是，胶束可以通过在酸性或还原微环境,细胞内失稳释放DOX，从而诱导DOX定位在细胞核中。进一步的研究可能集中在胶束的细胞内定位，通过荧光探针对核内体进行染，细胞内吞途径和胶束和DOX扩散的潜在核内体逃逸的详细机制。
在体外实验检测PEG-SSBAP的抗癌机制
既然PEG-SSBAP胶束包裹的阿霉素在生理环境中释放的非常的慢，但是在细胞内环境中是有效率的，胶束是一种很好的控制药物释放抵抗毒性的载体。在体外实验的研究中揭示了400ug/ml的PEG-SSBAP本身在MCF-7、H e p G2和SKOV-3的微小毒性。（图4a），表明了PEG-SSBAP胶束的好的细胞相容性。BAP和半胱胺作为PEG-SSBPA的副产品当其浓度在400ug/ml时在MCF-7、H e p G2和SKOV-3细胞中表现出很低的细胞毒性，细胞活性要大于80%。（图S8）。相反的，PEG-SSBAP负载的阿霉素在细胞中有细胞毒性。（图4b-d）。进一步发现胶束的抗癌活性与细胞株类型相关。举一个例子，5ug/ml的阿霉
素浓度，负载的Dox 胶束有效的抑制SKOV-3和H e p G2细胞的增长。（细胞活性为60%），但是在MCF-7中的抑制作用适中，细胞活性表现为90%，除了细胞的种类，阿霉素的浓度对于癌细胞的敏感性是影响抗癌活性的另外的一个影响因素。这个可以理性的解释为对于HepG2细胞，胶团可以与Dox比较抗癌活性，在do x的浓度为1-10ug/ml时。（图4d）。但是在一个低的do x浓度（0.1-1ug/ml），在所有的这些癌细胞中，PEG-SSBAP负载的阿霉素的抗癌效力是比单纯的阿霉素差的，这是因为Dox纯物质可以快速的进入细胞核并且插入DNA来杀死细胞，但是胶束需要更长的时间来转移并且脱掉Dox让其进入细胞核，这些假设可以通过Dox的分布数据来支持（图3d/e），在1小时和24小时下，PEG-SSBAP负载的阿霉素胶束相比单纯Dox 在MCF-7细胞的细胞核中有一个更高的Dox 聚集。
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