黄耀凌;刘智宏;白玉惠;王鹤佳;李丹;赵琪;张玉洁;吴辰斌;徐士新
【摘 要】The residue depletion of enrofloxacin injection in the swine was studied.The preparation of 10% concentration was administrated intramuscularly at a dose of 2.5 mg/kg twice daily for 3 days.Tissue samples were collected at 0,3,5,7 and 10 day after the last administration.The concentrations of residues including enrofloxacin and ciprofloxacin in tissues were analyzed and the withdrawal time was calculated by WT1.4 software.The result recommended that the withdrawal time of the 10% enrofloxacin injection in swine would be 14 days.%为研究恩诺沙星在猪体内的残留消除规律,验证休药期,以2.5 mg/kg体重肌内注射10%恩诺沙星注射液,每日2次,连续3 d.在最后一次给药后0、3、5、7、10 d时间点,采集肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和注射部位肌肉,HPLC法测定组织中的恩诺沙星及其代谢物环丙沙星的残留量,并用WT1.4软件计算休药期.结果显示,恩诺沙星在猪肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和注射部位肌肉的休药期分别是5.6、13.4、8.2、3.0、5.5 d.为保证兽药使用安全、消费者健康和食品安全,推荐恩诺沙星注射液在猪的休药期为14 d.版权保护
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【期刊名称】《中国兽药杂志》
【年(卷),期】中学英语园地2017(051)003
【总页数】7页(P48-54)
【关键词】恩诺沙星;猪;残留;休药期
【作 者】黄耀凌;刘智宏;白玉惠;王鹤佳;李丹;赵琪;张玉洁;吴辰斌;徐士新
【作者单位】中国兽医药品监察所,北京 100081;中国兽医药品监察所,北京 100081;中国兽医药品监察所,北京 100081;中国兽医药品监察所,北京 100081;中国兽医药品监察所,北京 100081;中国兽医药品监察所,北京 100081;中国兽医药品监察所,北京 100081;中国兽医药品监察所,北京 100081;中国兽医药品监察所,北京 100081
财政收入
【正文语种】中 文
【中图分类】S859.796
恩诺沙星是动物专用的氟喹诺酮类抗菌药，具有抗菌谱广、杀菌力强、作用迅速、体内分布广、副作用小等特点，广泛应用于畜禽养殖[1]。由于恩诺沙星在动物体内可不同程度代谢成环丙沙星，因此可食性组织中的药物残留标示物为恩诺沙星和代谢物环丙沙星。这类药物对动物骨骼生长发育有不良影响，禁用于幼龄动物和孕畜，同时对胃肠道、中枢神经、肝细胞均有一定的危害[2]。因此我国农业部发布了恩诺沙星在猪组织中的最高残留限量(MRL)：肌肉100 μg/kg、肝脏200 μg/kg、肾脏300 μg/kg和脂肪100 μg/kg[3]，并在农业部278号公告中规定了猪在使用恩诺沙星注射液后的休药期为10 d[4]。本实验通过对市售恩诺沙星注射液在猪体内残留消除规律的研究，计算恩诺沙星在猪不同组织的休药时间，以期为安全使用兽药和正确执行休药期规定提供科学的依据和建议。 1.1 药品与试剂 10%恩诺沙星注射液：批号1603002，山东兽药生产厂家提供；恩诺沙星对照品：含量99.9%，批号H0081206，中国兽医药品监察所提供；盐酸环丙沙星对照品：含量99.8%，批号H101310，中国兽医药品监察所提供；Bond Elut-C18固相萃取柱：100 mg/mL，安捷伦公司；甲醇、乙腈、正己烷：谱纯；柠檬酸、乙酸铵、磷酸、三乙胺、磷酸二氢钾，均为分析纯。
1.2 仪器设备 Agilent1260高效液相谱仪(配荧光检测器)；固相萃取装置；pH计；高速冷冻离心机；Milli—Q超纯水仪。
1.3 溶液配制 0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液：取浓磷酸3.4 mL，用水稀释至1000 mL，用三乙胺调pH值至2.4。柠檬酸/乙酸铵缓冲液：取柠檬酸10.56 g，乙酸铵7.87 g，用水溶解并稀释至1000 mL，混匀。磷酸盐缓冲溶液(用于肌肉、脂肪组织)：取磷酸二氢钾6.8 g，加水溶解并稀释至500 mL，用5.0 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0。磷酸盐溶液(用于肝脏、肾脏组织)：取磷酸二氢钾6.8 g，加水溶解并稀释至500 mL，混匀。洗脱液：取乙腈20 mL，用0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液稀释至100 mL，混匀。
1.4 试验动物 三元杂交健康猪30头，雌雄各半，体重为53±6.6 kg，购自北京某猪场。其中对照组5头，给药组25头。试验前7 d，自由采食饮水，饲喂不添加任何抗菌药物的全价配合饲料，试验前后各组饲养条件相同。
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1.5 给药与样品采集 给药组以2.5 mg/kg体重剂量进行臀部肌内注射恩诺沙星注射液，每日2次，连续给药3 d，分两侧注射。最后一次给药后0、3、5、7和10 d分别随机宰杀5头，采集背长肌、肝脏、肾脏、脂肪和注射部位肌肉，于-20 ℃保存。
1.6 试验方法 采用实验室自建残留检测方法[5]对样品进行测定。
1.6.1 样品前处理 取(2±0.05)g样品，置50 mL离心管中，肌肉、脂肪试样加磷酸盐缓冲溶液10.0 mL，肝脏、肾脏试样加磷酸盐溶液20.0 mL，涡旋混匀，中速振荡5 min。15000 r/min离心10 min，取上清液于另一离心管中。肌肉、脂肪试样残渣中再加磷酸盐缓冲溶液10.0 mL；肝脏、肾脏试样残渣中再加磷酸盐溶液 20.0 mL，重复提取一遍。合并两次上清液，充分混匀，备用。
取肾脏上清液10 mL于另一50 mL离心管中，加5 mL正己烷，中速振荡5 min。5000 r/min离心5 min，取下层清液，混匀，备用。
固相萃取柱依次用甲醇、水各2 mL预洗。取备用液3.0 mL过柱，水1 mL淋洗，挤干。用洗脱液1.0 mL洗脱，挤干，收集洗脱液。经滤膜过滤后作为试样溶液，供高效液相谱法测定。
1.6.2 谱条件 谱柱：Phenomenex Luna 5u C18(2)柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液+乙腈(82+18, V/V)，使用前经微孔滤膜过滤(测肌肉和脂肪
组织用)；柠檬酸/乙酸铵溶液+乙腈(82+18, V/V)，使用前经微孔滤膜过滤(测肝脏和肾脏组织时用)；流速0.8 mL/min；检测波长：激发波长280 nm；发射波长450 nm；柱温40 ℃；进样量40 μL。
2.1 标准曲线 恩诺沙星和环丙沙星在0.5 ～ 800 ng/mL浓度范围内呈现良好的线性关系，其曲线方程分别为y = 3.6034x + 0.5218和y = 7.4225x + 1.0125，相关系数(R2)均为0.9999，标准溶液和组织谱图见图1和图2。
2.2 组织中药物残留 按实验室检测方法对采集的注射部位、背长肌、脂肪、肝脏及肾脏样品进行测定。按检测方法的残留量计算公式，计算样品中恩诺沙星及代谢物环丙沙星的残留量，并用同时测定的阳性添加样品的回收率进行折算，以折算结果作为样品中恩诺沙星及代谢物环丙沙星的残留量。分别计算每个时间点5头猪的注射部位、肌肉(背长肌)、脂肪、肝脏及肾脏样品中恩诺沙星和代谢物环丙沙星(表1)和总残留量(表2)。
表1和表2结果显示，药物在停药0 d的注射部位浓度最高，其次为肝脏、肾脏和背长肌，脂肪组织中的药物浓度最低。药物在组织中的代谢较快，在停药后第3天，肌肉(背长肌)、脂肪和肾脏中的药物浓度已低于MRL，分别为46.6 μg/kg、92.5 μg/kg和24.1 μg/kg；注射部
位在停药后第5 天低于MRL，为5.7 μg/kg；肝脏在第7 天低于MRL，为180.9 μg/kg。五种组织中的药物平均总残留量在停药后第7 天时均已降低至MRL之下。
2.3 休药期计算 采用WT1.4软件计算休药期，确保有95%的可信限使99%的残留低于MRL。10%规格恩诺沙星制剂在猪组织中的休药期计算和结果见表3，残留消除拟合图见图3。
结果显示，10%规格制剂在猪组织中的休药期分别为注射部位5.5 d、肌肉(背长肌)5.6 d、肝脏13.4 d、肾脏8.2 d和脂肪3.0 d，其中肝脏的休药期时间最长。为了确保消费者健康安全，建议10%规格恩诺沙星注射液在猪的休药期为14 d。
通过市售恩诺沙星注射液在猪的残留消除试验，发现这种市售注射液在猪组织中的残留消除规律与其他文献报道相近，代谢消除较快[6-8]，与文献报道相比，都是肝脏和肾脏残留浓度较高，并迅速消除。但从组织残留浓度看，与刘小艳等[7]试验结果比较，本试验的药物总残留浓度较高，因为刘小艳报道其制剂在停药第5天后，各组织中未检测到药物残留。与仲锋等[6]试验结果比较，注射部位、肝脏、肾脏和脂肪在停药后第10天的残留浓度比较接近，本试验在停药后第10天的残留浓度分别为注射部位为未检出、肝脏为116.0 μg/kg、
肾脏为8.9 μg/kg、脂肪为未检出；仲锋报道的残留浓度，注射部位为未检出、肝脏为95.2 μg/kg、肾脏为122 μg/kg、脂肪为未检出。这是因为肝脏和肾脏分别是恩诺沙星的代谢和排泄器官，休药后第10天药物残留浓度在肝脏和肾脏仍高于肌肉和脂肪。本试验中药物残留在组织中含量与文献不一致，可能是药物制剂生产工艺差异等因素造成的。
本试验的休药期计算中采用的经回收率折算后的样品残留浓度数据来进行。经WT1.4软件分析，采用回收率折算数据计算的休药期在肌肉和肝脏较未折算回收率的休药期时间略长。未折算回收率数据计算的休药期分别是注射部位5.4 d、肌肉4.6 d、肝脏12.6 d、肾脏8.2 d和脂肪3.8 d。这可能是采用回收率折算得到的恩诺沙星总残留浓度相对较高，因而计算得到的休药期时间更长，但这更能保证畜产品的安全、消费者的健康。
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