简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，也可称为SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphisms)，STMS (Sequence-tagged microsatellites)。其串联重复的核心序列为1一6 bp，其中最常见是双核昔酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10一60腹膜癌
blm个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。 SSR具有以下一些优点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。 1 微卫星DNA的构成及特点
微卫星又称简单序列重复(Simple Se-quence Repeats，SSR)。一般以1-6个碱基为核心序列，首尾相连组成的串联重复序列。这种序列存在于几乎所有真核生物的基因组中，含量丰富，且呈随机均匀分布。它们不仅大量分布于基因的间隔区和内含子中，而且还分布于基因的外显子和调控区(如启动子、增强子)，真核生物平均每50-150 kb就存在一个微卫星位点，如在人类基因组中每6 kb就有1个微卫星，禽类基因组中约89 kb出现1个微卫星。微卫星DNA数目巨大，人类基因组中约有5×104-1×105个(CA)n重复序列，重复次数一般为15-60次，重复单位相同，其长度一般小于犯罪中止200 bp，但也有的更长。
每个特定位点的微卫星DNA均由两部分构成：中间的核心区和外围的侧翼区。核心区含有一个以上称为“重复”的短序列，一般该重复单位的碱基对数目不变，而串联在一起的重复单位数目是随机改变的，如果用一种不切重复单位的限制性内切酶把DNA分子切割成限制性片断，该限制性片断中位于核心区的外围即是侧翼区。人中不同个体可表现为侧翼区相同而串联重复单位的数目不同；也可为有相同数目的重复单位但侧翼区大小不同，或者两者均不同。对那些非微卫星DNA位点的DNA RFLP研究表明，每个位点的RFLP仅能检测到1个到数个等位基因。因此，可以推论，微卫星DNA位点的侧翼区变异数也仅有少数几个，这样人中该特定微卫星位点的等位基因差异，主要应来自不同数目的串联重复。
此外，微卫星DNA还具有以下特点：
1在正常人中显多态性现象，即微卫星DNA拷贝数在人中是可变的；
2具有遗传连锁不平衡现象；
3均可被转录，有些编码蛋白质，而另一些则不编码蛋白质(教学改革设想位于非转译区的5′和3′端)；
4属于不稳定的DNA序列，其数目在某些遗传病中有扩增现象，而这种扩增并非是减数分裂的重组造成，扩增可发生在减数分裂过程中，由一代传递给另一代，也可发生在有丝分裂中，导致嵌合体形成。与成熟人体细胞比较，微卫星DNA在胚胎时期有丝分裂很不稳定；
5在不同基因位点上的微卫星DNA的重复顺序可以不同，也可以相同。从理论上说，一种微卫星重复顺序的寡核苷酸探针可确定人类基因内约20个不同位点的微卫星，假设有20种微卫星重复顺序的探针，即可对人类任何基因组位点进行定位，应用前景极大。
2 微卫星的类型及其分布
研究表明(AC)n是真核生物包括人在内的生物基因组中含量最丰富的散在分布重复序列。
Weber检测了人类基因组中100多个重复数不同的(AC)n序列，利用一套精细的分类方式将微卫星分为三类：
完全重复序列，指在(AC)n重复中没有其他碱基分散于其中，其比例占总重复序列的64%；
不完全重复序列，指两个或多个不间断的重复(AC)n被连续的非重复碱基序列隔开，这些间隔区不超过三个，含量约为25%；
复合序列，指两类或两类以上的串联重复单位由不多于3wap上网个连续的非重复碱基分隔开，但不中断的重复单位的重复数大于5，其比例为11%。不同生物体的基因组中三种序列的比例不尽相同，在猪的基因组中三者的含量分别为71%、19%和10%。
3 微卫星的功能
微卫星DNA功能尚不完全清楚，目前普遍认为充当基因重组的热点，是基因重排和变异的来源，微卫星DNA通过改变DNA结构或通过与特异性蛋白质结合而发挥其基因调控作用。
4 微卫星DNA的检测
4.1 DNA指纹图谱法：根据不同位点的微卫星DNA可有相同重复顺序单位的特点，用一种核心重复顺序作为探针，可检测到许多不同位点的微卫星，经Southern Blot转移杂交，放射自显影在X光胶片上显现DNA指纹图谱，该图谱不表示任何特定微卫星位点，而是许多微卫星位点的集合状态。每个个体至少可显示18条以上的带纹，并且有高度的个体指导性。家系分析表明，该指纹以孟德尔遗传方式传递，如果用不同位点微卫星DNA核心重复顺序制作核苷酸探针，可得到不同的DNA指纹，因此该法在法医学上有很高的应用价值。
4.2 变性聚丙烯酸胺凝胶电泳检测法：
根据微卫星位点两端的互补序列合成引物，然后用PCR扩增出长度不同的片段，这种PCR扩增的不同长度片段用高分辨的变性聚丙烯酞胺凝胶电泳来区分，最后用AgNO3染得到结果。
该法分辨率、灵敏度明显高于琼脂糖电泳、放射自显影等方法，且操作时间短，在聚丙烯酞胺中加入甲酸胺和尿素还可以减少异源双链的形成，该技术在遗传病诊断、基因定位、尤其在法医学上日益广泛。
4.3 毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)：毛细管电泳法(CE)是近几年崛起的高效快速的分离分析技术，此法先以PCR扩增含有微卫星位点的目的DNA片段，然后利用CE进行分离分析。此法最主要的优点是快速、微量、分辨率高、重复性好、易于定量和自动化。CE能在20 min内分离长至几千KB的DNA片段，对于外显子大小的DNA片段，其分辨率可达1 bp。该技术目前已广泛应用于核酸定量、基因突变的检测、遗传病的诊断等，它与PCR和其它技术相结合将逐渐取代传统的琼脂糖和聚丙烯酞胺电泳。随着激光检测仪的引入，将会进一步提高分析灵敏度及分辨率。
4.4 PCR-RFLP或ASO检测法：以特定微卫星位点侧翼区互补序列合成引物，进行微卫星DNA位点的扩增，然后再用该位点的特异性探针进行RFLP检测或用该等位基因特异的寡核苷酸探针(ASO)东北电气发展股份有限公司进行印迹杂交、放射自显影，该法特异性强、可靠。实验表明，该法在法医学上，尤其是罪犯的刑事鉴定方面的应用是成功的。当微卫星DNA位点由一个或数个重复顺序的差异而产生不同的等位基因时，这种差异用传统的琼脂糖凝胶电泳和印迹杂交无法分辨，尤其在DNA片段很大而核心重复顺序很短的情况下，更无法分辨，采用该法检测，则可得到满意的结果。
4.5 多重PCR微卫星荧光标记全自动基因组扫描：多重PCR技术是指在同一PCR反应体系内对同一标本采用多种引物同时进行扩增，由Perkin-Elmer公司推出的微卫星荧光标记全自动基因分型技术已被普遍采用，利用FAM、TET和HEM 3种不同颜的荧光染料标记微卫星DNA引物，可以将多种不同荧光标记和不同扩增片段的PCR产物在同一加样孔中电泳，并且可将待测PCR产物与DNA内在分子量标准同时上样，通过顺序凝胶电泳，用GENESCAN(672)软件进行图像分析，精确计算出微卫星等位基因片段大小。本法具有产量高、成本低、快速简便等优点，显示了广阔的应用前景。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议