江西农业大学学报密级:
作用研究
作者姓名: 周雷
指导教师: 陈笑艳研究员
中国科学院上海药物研究所
煤矿施工组织设计学位类别: 理学博士2010年诺贝尔化学奖
学科专业: 药物分析学
培养单位: 中国科学院上海药物研究所
2017年5月
Study on the metabolism- and transport-mediated hepatotoxicity mechanism and drug-drug interaction of
nimesulide
By
Zhou Lei
A Dissertation Submitted to
The University of Chinese Academy of Sciences
In partial fulfillment of the requirement
For the degree of
Doctor of Medicinal Analysis
Shanghai Institutes of Materia Medica, CAS
May, 2017
中科院上海药物研究所
研究生学位论文声明
本人郑重声明：
奥肯定律
1. 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所
取得的成果。除文中已经注明引用的内容或属合作研究共同完成的工作外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。
2. 所呈交的学位论文，实验结果均由相应的实验数据分析得出，实验
数据真实可靠。
该声明的法律结果由本人承担。
学位论文作者签名：
日期：年月日
研究生学位论文版权使用授权声明
本人完全了解并同意遵守中科院上海药物研究所有关保留、使用学位论文的规定，即：上海药物研究所有权保留送交论文的复印件和电子文件，并提供论文的目录检索及借阅、查阅；上海药物研究所可以公布论文的全部或部分内容，可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编本学位论文。保密的论文在解密后遵守此规定。
作者签名：导师签名：日期：
I
致谢
本论文得到了国家自然科学基金[81573500和81503153]的资助。
本论文是在导师陈笑艳研究员的悉心指导下完成的，衷心感谢陈老师多年来对我的指导和帮助。导师敏锐的科研视角、严谨的治学态度和诲人不倦的精神使我受益匪浅。值此文论完成之际，向您献上我最诚挚的祝福和最崇高的敬意。
衷心感谢钟大放研究员在课题开展和数据解析中给予的指导和建议，让我从中受益良多。 特别感谢庞晓雁博士在肝细胞分离和培养、RT-PCR及Western Blot实验中给予的指导和帮助。
感谢李亮博士在UPLC/Triple TOF MS质谱分析和代谢物鉴定方面给予的指导和帮助。感谢杨勇博士在LC-MS/MS分析方法的建立方面给予的指导和帮助。
感谢杨瑛老师、孙斯文老师、陈春梅老师、姜金方、徐叶、侯翔宇、孔繁迪和唐崇壮在动物实验中给予的帮助。
感谢郭子涛老师和李秀立博士在转运体实验中给予的帮助。
感谢周家岚老师在体外药物代谢实验中给予的帮助。
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感谢雷鹏、左自清和曹华在对照品合成方面给予的帮助。
感谢同年级的陈照强、朱云婷、王玉兰和许静静多年来给予我的关心和鼓励。感谢我研究生期间的室友周婷婷、周然、徐媛媛和陈丽敏，感谢一起度过的美好时光。
感谢谢岑博士、刁星星博士、林丽珊博士、余京华博士、钟勘博士、杜江波博士、刘彩博士等师兄师
在我刚进实验室时给予的帮助和指导。感谢实验室的夏雨、孟健、高志伟、张逸凡、郭丽霞、朱庆、昝斌、詹燕等老师在生活和科研中对我的帮助。
感谢研究生教育处的何敏、林巍、胡忠良、王佩和吴永铮老师在学习和生活中对我的关心和帮助。
最后，我要深深感谢我的家人，感谢他们多年来对我学业的支持和鼓励。
亨利定律
谨以此文献给所有关心和帮助过我的亲人、师长和朋友们！
II
摘要
肝脏介导的药物代谢和转运在药物引起的肝损伤以及药物相互作用方面起着重要作用。药物的代谢活化过程能够产生反应性中间体，这些中间体可以通过耗竭GSH引起氧化应激，或与细胞内蛋白发生共价结合，从而产生细胞毒性；药物或其代谢物若抑制胆汁酸的肝胆转运过程，导致胆汁酸在肝脏中蓄积，则可能引发胆汁淤积型肝毒性。此外，药物可以通过影响代谢酶和转运体活性，改变同服药物的体内处置过程，从而影响同服药物的药效或毒性。
本论文拟以具有肝毒性的非甾体抗炎药尼美舒利（NIM）为研究对象，利用各种代谢和转运体研究模
型，探索NIM基于代谢与转运的肝毒性机制，并考察代谢酶和转运体介导的NIM与临床常用药物的药物相互作用，为尼美舒利的临床合理用药和安全性评价提供重要科学依据。
1.NIM代谢活化与肝细胞毒性研究
NIM是一种选择性抑制环氧合酶Ⅱ的非甾体抗炎药，临床使用中有严重的肝损伤报道。已有文献指出NIM硝基还原为氨基的代谢物M2在代谢酶的催化下能发生代谢活化，产生反应性中间体，该过程被认为与NIM的肝细胞毒性有关。然而，体外肝细胞实验发现，M2在大鼠原代肝细胞中孵化24 h并不产生细胞毒性，而NIM能产生浓度依赖性的毒性，提示M2的代谢活化过程不是导致NIM肝细胞毒性的原因。因此，本研究的目的为考察NIM是否存在其它代谢活化途径，并评价这些代谢活化途径与NIM肝细胞毒性的关系。
在包含NIM，NADPH和GSH的人或大鼠肝微粒体孵化体系中，共检测到两种GSH结合物。经UPLC/Triple TOF MS法鉴定，一种为氧化脱硝基的GSH 结合物（NIM-OH-GSH），另一种为硝基还原为氨基的GSH结合物（NIM-NH2-GSH）。
NIM-OH-GSH在以NIM为底物的孵化体系中的生成量要远远高于以氧化脱硝基代谢物NIM-OH为底物的孵化体系中的生成量，并且环氧化物水解酶能显著抑制NIM-OH-GSH在NIM孵化体系中的生成，提示NIM-OH-GSH主要由NIM经环氧化过程产生，而非NIM-OH直接氧化产生。酶表型实验进一步证明C
YP1A2是催化NIM氧化活化产生NIM-OH-GSH的主要酶。
III
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