冯英巧;杨元生;崔淑兰;陈垦;王晖
【摘 要】肝纤维化是肝脏对持续损伤作出的以细胞外基质过度累积为主要特点的一种常见的免疫应答.目前尚无理想的药物或方法,因此研究肝纤维化的发生机制对寻有效的药物及其方法有重要意义,理想的动物实验模型是上述研究的关键所在.尽管目前有四氯化碳造模法、乙醇造模法及免疫造模法等肝硬化动物模型制备方法,但各法均有其利弊,而理想的、重复性好且适合广泛推广应用的标准模型仍需继续探索.本文对肝纤维化动物模型的研究和应用进展作一综述.
【期刊名称】《广东药学院学报》
警用手【年(卷),期】2013(029)005丁肇中
【总页数】5页(P570-574)
盖达尔
ov-10【关键词】肝纤维化;肝硬化;动物模型;机制;
【作 者】冯英巧;杨元生;崔淑兰;陈垦;王晖
【作者单位】广东药学院临床医学院,广东广州510006;广东药学院附属第二医院,广东广州510006;广东药学院护理学院,广东广州510006;广东药学院临床医学院,广东广州510006;广东药学院中药学院,广东广州510006
【正文语种】中 文
【中图分类】R-332
肝纤维化(liver fibrosis，LF)是肝脏遭受反复或慢性损伤后的一种损伤与修复过程，主要与慢性炎症和引起慢性肝脏损伤的化学因素相关，现已成为一个发病率和死亡率都很高的世界医学难题(非酒精性脂肪性肝病平均累及世界人口的10%～24%，在我国高达15.35%)，各种肝病多数经肝纤维化最后发展为晚期的肝硬化成为肝病死亡的主要原因[1]。目前除了在肝硬化晚期进行肝移植尚无其他有效的策略，因此，构建能够模拟人体肝纤维化甚至肝硬化过程的理想动物模型成了探索早期诊断、寻肝纤维化有效策略、改善肝硬化病情和预后的关键。本文就近几年有关肝纤维化的建模及其应用进展作一综述。
1 化学造模法
1.1 四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化模型
CCl4可引起肝脏损伤及纤维化而被广泛用于诱导肝纤维化动物模型。其机制是直接溶解肝细胞膜，经肝细胞细胞素P450依赖性混合功能氧化酶的代谢生成高反应性的CCl3；导致小叶中央肝细胞坏死，触发基质开始在中央静脉周围沉积并逐步与相邻的中央静脉形成桥接，几乎不出现胆管反应[2]。现有的制备方法主要有4种：①单纯CCl4诱导法，最为常用。该方法系按0.5～2 mL/kg体质量腹腔注射1∶1的CCl4橄榄油溶液，6～9周后可以导致肝纤维化[3]。②CCl4联合制备法，该方法系用含0.35 g/L的钠的蒸馏水作为大鼠的唯一饮用水饮用1周后按0.05 mL/kg体质量腹腔注射40% CCl4中性菜籽油溶液4周，每周2次，同时以φ=10%的乙醇溶液为其唯一饮用水；第5周开始改为50% CCL4中性菜籽油，按0.05 mL/kg腹腔注射4周，每周2次；同时改50%的乙醇溶液为其唯一饮用水[4]。③CCl4复合法，该方法系采用高脂低蛋白食物(以含φ=0.5%胆固醇的玉米面为饲料，实验第1、2周φ=20%猪油为饲)，φ=30%酒精为唯一饮用水，皮下注射CCl4 (第1次按0.05 mL/kg体质量注射，以后每隔3天按0.03 mL/kg体质量皮下注射40%的CCl4猪油油剂，4周
后即可形成肝纤维化[5]。④AAF/CCl4联合制备法，该方法系先给实验动物(SD大鼠)0.02%颗粒状的乙酰氨基芴(acetylaminofluorene，AAF)混于饲料中喂养5 d，后以1∶1稀释的CCl4橄榄油混合液按2 mL/kg体质量腹腔注射1周，每周2次，从第2周开始CCl4剂量改为1 mL/kg体质量并停止加入AAF，共6周[6]。
单纯CCL4法操作简便、耗费少，肝纤维化程度从第4周的平均4.9%逐渐达到第8周平均9.2%的高峰，模型成功率达89.33%，能很好地模拟人类肝纤维化S0～S4期的病理变化且与乙肝病毒感染后的病理特征相似[7-8]。现被广泛应用于研究肝纤维化发病机制、抗纤维化药物筛选、抗纤维化药物的作用机制等。AAF/CCl4法中肝细胞坏死和炎症情况与单纯法相似，而纤维化明显可见多个门-中央桥接甚至肝硬化，造模周期相对较短[9-12]。但CCl4 肝毒性剧烈，免疫反应较轻对自身免疫性肝病引起的肝纤维化研究效果不佳。是否存在一种造模周期短、同时可诱导肝脏产生明显免疫反应的造模方法以及AAF/CCl4法中AAF对实验的影响等都还有待进一步研究，或许CCl4联合猪血清免疫诱导法能弥补这一模型的部分缺点。
1.2 二甲基亚硝胺(DMN)诱导的肝纤维化模型
DMN是一种可导致肝纤维化的肝毒剂，同时具有致癌和致突变性[13]，它在体内通过肝微粒体主要代谢为乙醛。乙醛是一种高反应活性化学物，可与核酸、蛋白质等重要的生命物质结合并使其发生甲基化导致肝细胞坏死、细胞外基质进行性增加，出现肝纤维化。目前常用的造模方法是：通过给实验动物腹腔注射DMN (5～10 mg/kg体质量) 每周连续3 d，4～8周后即可成功诱导出肝纤维化模型。最近，Hyon等[14]使用该方法在NOD/SCID小鼠中成功诱导出的肝纤维化模型，该模型可能对评价肝纤维化细胞疗法(如人骨髓间充质干细胞)的有效性和安全性有很高的价值。此方法造模简便，造模周期短，Jin等研究[15]注射DMN后的第2周肝纤维化程度最明显达3.72%，第4周达3.73%，肝纤维化形成稳定，可用于学研究。但DMN容易引起肝细胞坏死出血导致肝衰竭，死亡率较高且DMN是致癌物(无论是否持续接触DMN，多年后都有较大的概率发展为肝癌)。因此，实验时实验人员应做好防护措施谨慎使用[16]。我们在近期应用葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)诱导炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)模型时发现DSS能使肝脏发生明显纤维化病变。DSS是一种水溶性多聚阴离子，自然状态易分解，高纯度密封保存具有良好稳定性，结构似天然粘多糖，具有抗凝、抑制巨噬细胞酶的释放、潜在激活补体旁路途径、活化B 细胞和T 细胞、促进B 淋巴细胞生成、影响体液免疫等作用，还有加速DNA片段杂
交率、稳定特定蛋白的作用。此外，DSS可与β-脂蛋白作用，加速其从血浆清除的速度。我们应用ρ=5%DSS饲养BALB/C小鼠4周可获得肝纤维化模型，未见小鼠死亡，实验动物耐受性较好，建模成功率及其发病机制有待进一步扩大样本量研究；其次，由于它能诱导机体产生免疫应答可能将是一种可同时用于研究免疫性肝疾病所致肝纤维化的较理想的肝纤维化模型。
2 乙醇造模法
肝脏是酒精代谢、降解的主要器官，临床上酒精性肝纤维化的病例很多，但整个发病过程及病理与其他疾病所致肝纤维不同且肝损伤的分子机制仍不十分清楚。研究表明酒精可增加肝细胞膜的通透性导致细胞膜缺损，增加肝细胞细胞膜的磷脂、脂质过氧化产物及电荷量，在线粒体中激活caspase-9和-3，诱导细胞的凋亡[17-18]。经典的酒精性肝纤维化的模型主要有2种：①Lieber-DeCarli模型：让啮齿类动物自由饮用含有乙醇的液体饲料(唯一的饮食来源)，其中乙醇可替代碳水化合物产生的50%的热量，并逐步使实验动物摄入乙醇所产生的热量达到总摄入热量的36%[19]。该模型可形成脂肪肝，但不出现肝纤维化相关表现，同时实验动物厌酒诱导成功率低给造模带来了很大的挑战。为此，有研究将实验动
物改为狒狒，在模型中可观察到实验动物肝纤维化，1～3年后有1/3的狒狒出现了肝硬化可重现人类酒精性肝纤维化大部分的病理改变，但实验动物短缺、成本昂贵、造模时间长，很难推广[20]。②Tsukamoto-French模型：对实验动物(啮齿类动物)采用持续胃内灌注含酒精的高脂流质饮食从而维持一个相对较高的酒精血药浓度对肝脏造成损伤诱导肝纤维化[21]；随后有研究对该法进行了改进，给实验大鼠胃内持续灌注含有60%的乙醇(1 mL/kg体质量)，橄榄油(2 mL/kg体质量)和吡唑(25 mg/kg-1·d-1) 9周[22]。现已被用于研究质膜蛋白质组对肝硬化的作用[23]，探索酒精性肝疾病的机制、寻酒精性肝纤维化药物新的靶点和策略。尽管该法可在短期内诱导肝纤维化，但肝纤维化程度较轻，不易发展为肝硬化、且实验技术要求较高、费用昂贵，推广应用尚需进一步改进使肝纤维化程度加重并降低造模成本，而基因敲除技术的应用将可能改变这种状况。
3 免疫造模法
免疫性肝纤维化主要是由肝脏自身出现免疫反应所引起的疾病，其病因尚不清楚，而其他因素(病毒、酒精、血吸虫及某些化学物质等)所致肝纤维化也常伴随不同程度的免疫反应。现有造模方法主要是对实验动物反复腹腔注射异种血清或蛋白(猪血清3. 5 mL/kg、血
吸虫血清、人或牛血清白蛋白等)，每周2次，连续8周[24]。该法的独特之处在于异种血清主要通过MHCⅡ分子和炎症因子激活肝干细胞HSC产生免疫应答导致的肝脏损伤，在这个过程中肝纤维化较轻而免疫反应强烈并持续存在[25-27]，能很好地重现其他模型所不能呈现的人类自身免疫性肝疾病所致肝纤维可能的过程和机制，使该模型在抗肝纤维化的免疫物的筛选和评估方面具有很大优势[28]。同时，有研究发现猪血清诱导模型中大鼠的膜联蛋白A2 (ANXA2)在肝纤维化的S4期明显高于S0期，而人类的ANXA2在S2期也高于S0期1.4倍，在受到乙肝病毒刺激时ANXA2会从细胞核膜和细胞质中转移至细胞膜上[29]，这将可能成为免疫和病毒性肝疾病诊断的一个新指标。此外，近来有研究发现血红素加氧酶-1(HO-1)对免疫性肝纤维化有重要影响，HO-1高表达可以减少肝纤维化的生化指标和病理检查纤维化程度减轻，相反，HO-1低表达纤维化程度加剧，这为抗肝纤维化药物研究提供了一个新的方向[30]。但肝纤维化较轻对评价抗纤维化药物的疗效欠佳已成为一个亟待解决的新问题。不过最近有研究显示环氧合酶-2抑制剂塞来昔布可引起肝细胞坏死明显促进猪血清诱导的肝纤维化，此发现将可能有效的弥补该模型这一缺点[31]。虽然目前尚无相关模型的报道，但如果在实验注射血清后加用适量的激素(如塞来昔布等)将可能使模型既出现明显的免疫反应又有明显的肝纤维化，进一步改善造模方法。
4 病毒性肝纤维化动物模型
麦克白
HCV/HBV感染是被机体清除还是持续感染均由病毒与宿主之间复杂的相互作用决定，但人类肝炎病毒不感染啮齿类动物已得到证实，这也严重影响了病毒性肝炎研究的进展。近来有研究使用黑猩猩、uPA/SCID或Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/-小鼠感染模型，其中由于黑猩猩属于灵长类动物和人类的免疫系统非常接近能很好地重现人类各种肝疾病所致的肝纤维化，但造价昂贵且涉及一些伦理问题等。uPA/SCID小鼠可感染乙肝病毒或丙肝病毒，但死亡率低、养殖效率低；Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/-小鼠克服了这些缺点，但由于富马乙酰水解酶(FAH)的缺失导致有毒的酪氨酸分解代谢产物在小鼠肝细胞内积累加剧了肝细胞种植的选择压力，不过通过食用2-1，3-环己烷二酮(NTBC)可有效防止毒物的堆积[32]。与此同时，有研究发现人源肝性嵌合体小鼠感染模型中注射HBx基因缺陷乙肝病(HBV)的小鼠不能检测到HBV血症，除非与HBx基因的表达质粒共注射证明HBx蛋白是病毒复制必不可少的，注射了含有完整HBx蛋白的小鼠可恢复乙肝病毒的传染性[33]。有进一步研究表明HBx蛋白可通过提高线粒体的钙吸收和活化钙池操纵钙离子通道(store-operated calcium entry，SOCE)调节细胞内钙离子信号的分子水平影响HBV复制和HBV相关性肝癌的发展并且这将可能成为抑制HBV的复制和相关肝病的新靶点[34]。该模型主要适用于研究在病毒感染期间
病毒的复制、观测肝细胞发生的变化，如先天免疫反应、细胞应激和代谢及药物疗效的研究反应[35]。但由于嵌合体动物缺乏人体免疫细胞，限制了对炎症和免疫力的研究。尽管该模型有局限性，但这仍是个具有巨大潜力的病毒性肝炎小鼠模型，对寻抗肝炎病毒的策略有一定意义。
5 其他造模法
海浪预报除上述常用建模方法外，尚有胆管阻塞性肝纤维化模型[36]、转基因肝纤维化动物模型[37]等。其中，胆管阻塞法造模，效果确切，炎症反应轻，造模周期短，6～8周即可见到门脉高压、腹水、侧支吻合、高动力循环等[38-39]，但此法操作繁琐易出现胆漏、胆管或胆囊囊肿及破裂，死亡率较高。而最近研究发现，聚糖基因敲除的小鼠(Dcn-/-)会加重肝纤维化影响损伤修复，将可能用于联合其他造模方法改进现有模型[40]。
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