大鼠肝微粒体法评价20种中药有效成分对CYP2C9酶的作用 张远冬1，刘学庆1，郭延垒2，张有金2，石 亮2，王二豪2，于 超 2 （400016重庆，重庆医科大学：公共卫生学院生殖生物学研究室1，生命科学研究院2）
[摘要] 目的 建立体外大鼠肝微粒体中CYP2C9酶活性测定方法，并以此方法评价20种中药有效成分单体对大鼠CYP2C9酶的作用。方法检索词 以双氯芬酸（Diclofenac）为探针，在实验组大鼠肝微粒体孵育体系中加入20种中药有效成分单体，在37 ℃水浴温孵15 min后冰乙腈终止反应，HPLC测定各孵育体系中探针药物的代谢产物4＇-羟基双氯芬酸的转化率，并与对照组比较其差异来评价各有效成分对CYP2C9酶活性的作用。结果 4＇-羟基双氯芬酸、双氯芬酸及其内标香豆素三者分离良好且无其他内源性物质干扰；动力学考察表明双氯芬酸在0.25 mg/mL的大鼠肝微粒体体系中孵育15 min，测得酶动力学参数Vmax为0.1456 nmol/(min·mg)，Km布莱恩疯狂英语为8.270 μmol/L；抑制实验考察发现：黄芩素、蛇床子素、大黄素、獐牙菜苦苷、淫羊藿苷、白藜芦醇实验组中4＇-羟基双氯芬酸转化率分别为（402.60±10.58）、（210.90±10.26）、（414.46±10.32）、（509.83±26.45）、（355.44±15.87）、（387.34±22.16）pmol/(min·mg)，显著低于对照组[（735.80±17.27涡流纺
） pmol/(min·mg)，P＜0.05]，其他中药成分实验组与对照组比较，其转化率无统计学差异。结论 建立了中药有效成分对CYP2C9酶作用的体外大鼠肝微粒体研究方法，并初步评价了黄芩素、蛇床子素、大黄素、獐牙菜苦苷、淫羊藿苷、白藜芦醇对CYP2C9具有抑制作用，在临床联合用药中需注意其可能引起的药物-药物相互作用。 [关键词] 大鼠肝微粒体；CYP2C9；中药有效成分
[中图法分类号] [文献标志码] A
Effects of CYP2C9 activities in rat live microsomes by 20 active constituents of chinese herbal drugs
Zhang Yuandong1，Liu Xueqing1，Guo Yanlei2，Zhang Youjing2，Shi Liang2，Wang Erhao2，Yu Chao2 (1Reproductive Biology Laboratory,School of Public Health,2Institute of Life Sciences,Chongqing Medical University,Chongqing,400016,China)
[Abstract] Objective To establish a method for evaluating the activity of cytochrome P45
0 2C9 using diclofenac as the probe compound in rats liver microsomes (RLM) in vitro, and investigate the impact of 20 active constituents of chinese herbal drugs on CYP2C9 activity. Methods Diclofenac and 20 active constituents of chinese herbal drugs were incubated with rat liver microsomes for 15 min at 37 ℃, and the reaction was terminated by cold acetonitrile, and the theconvert ratio of 4＇-Hydroxydiclofenac was determined by HPLC. Finally, the effects of 20 active constituents of chinese herbal drugs on CYP2C9 activities was evaluated by compaired theconvert ratio with control group. Results 4＇-Hydroxydiclofenac, Diclofenac and Coumarin were perfectly separated, Diclofenac reacted with 0.25 mg/mL RLM for 15 min, the kinetic parameters was shown that Vmax was 0.1456 nmol/(min·mg), and Km was 8.270 μmol/L; Among the 20 active constituents, Baicalein, Cnidiadin, Emodin, Swertiamarin, Icariin, Resveratrol were found to have a strong inhibition on CYP2C9 with theconvert ratio of 402.60±10.58,210.90±10.26,414.46±10.32,509.83±26.45,355.44±15.87, 387.34±22.16[pmol/(min·mg)], which were significantly lower than control group 735.80±17.27[pmol/(min·mg), P＜0.05]. Conclusion The method of rats liver microsome
s for evaluating influence of active constituents of chinese herbal drugs on CYP2C9 activity was successfully established. Baicalein, Cnidiadin, Emodin, Swertiamarin, Icariin, Resveratrol have inhibited CYP2C9 activity in vitro, which indicated we should to pay a ttention to the drug-drug interactions when these active constituents are used concomitantly with other drugs in clinical.
[Key words] rat liver microsomes ; CYP2C9; active constituents
Supported by the Major Project of New Drug Science and Technology (2010ZX09401-306-1-1) and the Project of Scientific Technological Innovation Capacity Construction of Chongqing(CSTC2010AA5058). Corresponding author: Yu Chao, E-mail:yuchaom@163
细胞素P450(cytochrome P450 proteins, CYP450)是人体内主要的药物代谢酶，库仑法CYP2C9是其中最重要的亚型酶之一，约占CYPs总量的10%～20%[1]，临床上约15%的药
物经由CYP2C9代谢，包括非甾体类抗炎药、磺酰脲类降糖药、血管紧张素Ⅱ抑制剂，以及临床常用口服抗凝剂（S）-华法林等[2]。其中，经CYP2C9代谢的苯妥英、（S）-华法林和甲苯磺丁脲等常用药物的窗狭窄、安全性低[3]。在临床联合用药时，CYP2C9酶被合用药物竞争性诱导或抑制，极易改变上述药物的药动学行为及药效，导致毒副作用的发生。因而，评价药物对CYP2C9酶的诱导或抑制能力极其重要。而酶活性的测定则是评价过程中的关键环节，因此，建立准确可靠的酶活性测定方法对于预测和评价药物相互作用潜在的风险性具有重要意义。
目前，临床中常常进行中西药联合用药，而中药有效成分对CYP酶的抑制或诱导作用引起体内其他药物蓄积或清除加快，导致药物药效降低或毒副作用的发生频率大大增加。以往的研究报道了多种中药提取物或有效成分对CYP2C9具有诱导或抑制作用。如Yuko taki等[4]报道银杏叶提取物体内诱导CYP2C9酶活性导致华法林抗凝作用增强，出血副作用增加；Si等[5]报道了多种黄酮及黄酮醇对CYP2C9具有强抑制作用；Qiu等[6]报道了丹参酮是一个CYP2C9 酶的竞争性抑制剂。因此，研究更多的中药有效成分对CYP2C9的作用对预防和降低药物-药物相互作用风险及临床合理安全用药具有重要意义。本文通过建立快速
、简便、准确的方法评价了20种中药有效成分对CYP2C9酶的作用，为进一步研究有效成分或相关药物的体内代谢和安全性评价提供参考，以期能够指导临床合理用药，避免药物联合用药时相互作用的发生。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
LC-2010A HT高效液相谱系统；TB-85型恒温水浴箱（日本岛津公司）；R21G型高速冻离心机（日本日立公司）；XS-105十万分之一精密天平（瑞士METTLER TOLED公司）。4＇-羟基双氯芬酸（4＇-Hydroxydiclofenac，32412-10MG，黄晨霄Sigma）；双氯芬酸钠盐（Diclofenac sodium salt，D6899-10G，Sigma）；香豆素（Coumarin，C4261-100G，Sigma），葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸水合物(β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrate，β-NADP+)均购自Sigma 公司，甲醇、乙腈（谱纯）购自TEDIA公司，其他试剂均为国产分析纯。
白藜芦醇（Resveratrol，R5010-100MG）、丹皮酚（1,2-Dichloro-4-nitrobenzene，D688
00-100MG）购自Sigma公司；栀子苷（Geniposide，HPLC≥98%）购于成都普思生物科技有限公司；黄芩素（Baicalein，0715-9909）、苦杏仁苷（Amygdalin，820-200002）、蛇床子素（Cnidiadin，0822-9802）、葛根素（Puerarin，752-200108）、绿原酸（Chlorogenic acid，0753-9910）、大黄素（Emodin，756-8902）、芦丁（Rutin，0080-9705）、橙皮苷（Hesperidin，0721-200010）、柴胡皂苷d(Saikosaponind，110778-200506)、五味子乙素（γ-Schisandrin，110765-200205）、五味子甲素（Deoxyschizandrin，0764-200107）、土贝母苷甲（Tubeimoside 1, 1536-200001）獐牙菜苦苷（Swertiamarin，0785-9502）、延胡索乙素（Tetrahydropalmatine，0726-9906）、淫羊藿苷（Icariin，0737-9910）、贝母素甲（Peimine，750-9303）、芍药苷（Paeoniflorin，0736-200014）均购自中国食品药品鉴定研究院。
1.2 谱条件
采用谱柱Agilent ZORBAX SB-C18反相柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：乙腈-0.01 mol/L醋酸铵（48:52，体积比，用醋酸调pH至3.60），流速1.00 mL/min，柱温：30 ℃，检测波长：280 nm。
1.3 标准品溶液的配制
精密称取4＇-羟基双氯芬酸0.00317 g，甲醇配制成10 mmol/L的母液；精密称取双氯芬酸钠盐当飞机飞越彩虹0.00321 g，用超纯水配制成10 mmol/L的母液；精密称取内标香豆素0.00149 g，用乙腈配制成10 mmol/L的母液，均置于-20 ℃冰箱中储存备用。称取适量的各中药有效成分单体，用乙腈或超纯水配制成1mg/mL母液储存-4 ℃冰箱备用。
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