产生途径的发现与证实
徐岩，吴，范文来，朱兵峰
（江南大学酿酒科学与酶技术中心，江苏无锡214122）
摘要：四甲基吡嗪不仅是中国白酒风味相关的重要化合物，同时具有特殊的药理作用，赋予中国白酒有益健康
的功能。江南大学对中国白酒中四甲基吡嗪的来源及产生机制进行了深入的研究，研究验证了中国白酒中四甲基吡
嗪产生的主要途径来源于微生物的代谢反应，并非美拉德反应。对江南大学在“中国白酒169计划”中关于四甲基吡
嗪的研究结果进行了总结，包括产生四甲基吡嗪的微生物、产生途径及代谢调控等。
关键词：微生物；四甲基吡嗪；枯草芽孢杆菌；乙偶姻；生物代谢调控；白酒风味物质
中图分类号：Q93-3；TS262.3文献标识码：A文章编号：1001－9286（2011）07－0037－04
The Discovery&Verification of the Production Pathway
of Tetramethylpyrazine(TTMP)in Chiese Liquor
XU Yan,WU Qun,FAN Wenlai and ZHU Bingfeng
(Liquor-making Science&Enzyme Technology Center of Jiangnan University,Wuxi,Jiangsu214122,China)
Abstract:TTMP is not only an important liquor flavor-related compound but also in possession of special pharmacological functions benefical to people's health.We have studied the source and the production mechanism of TTMP in liquor in depth in Jiangnan University.The research proved that TTMP in liquor mainly comes from microbial metabolism but not from Maillard reaction.In this paper,the research accomplishments of TTMP in“China Liquor169Planning”in Jiangnan University were summed up including the microbes producing TTMP,the prodcution path-way of TTMP,and the control of TTMP production etc.(Tran.by YUE Yang)
Key words:microbe;TTMP;Bacillus subtilis;acetoin;biological metabolism control;liquor flavour compo
unds
四甲基吡嗪，又称川芎嗪，具有烘烤香气、甜香[1]，是中国白酒中的重要香气化合物[2]。同时它作为中药材川芎根茎的主要活性生物碱成分，具有特殊的药理作用[3]，因此，也赋予了中国白酒有益健康的功能。四甲基吡嗪作为中国白酒中健康的风味成分，其来源得到了极大的关注。由于其在酱香、芝麻香等采用高温曲发酵的白酒中普遍存在，又呈现焙烤香，而食品烘焙过程中羰基化合物（还原糖类）和氨基化合物（氨基酸和蛋白质）会发生非酶促的美拉德反应，α-氨基酸与α-二羰基化合物经Strecker降解反应会产生吡嗪类化合物[4]，因此，长期以来一直认为，中国白酒中的四甲基吡嗪主要由美拉德反应产生[5-6]。
在“中国白酒169计划”中，针对这一重要风味物质的形成机理，江南大学在《重要香与味成分生成机理的研究》中将中国白酒中四甲基吡嗪的来源及产生机制作为重点内容进行了研究[7]。通过现代风味化学、微生物学与代谢工程等科学理论和先进技术手段，首次证实了中国白酒中四甲基吡嗪并非美拉德途径所产生。通过对中国白酒中高产四甲基吡嗪前体乙偶姻功能菌株的筛选与功能菌株代谢机制的分析，确定了中国白酒中四甲基吡嗪的产生机制为：功能菌株糖降解产生丙酮酸，两分子的丙酮酸缩合生成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸脱羧产生乙偶姻，发酵体系中的乙偶姻和主要由氨基酸转化而来的氨经过非酶促反应生成四甲基吡嗪。同时，基于四甲基吡嗪产生机制，建立了四甲基吡嗪发酵合成的代谢调控技术，有效提高了四甲基吡嗪发酵合成能力，最终证实并实现
收稿日期：2011－05－06
作者简介：徐岩，男，博士，教授，博士生导师，江南大学酿酒科学与酶技术中心主任、工业生物技术教育部重点实验室主任、教育部新世纪优秀人才、教育部“长江学者和创新团队发展计划”团队带头人，获得国务院政府特殊津贴、全国优秀教师、江苏省有突出贡献专家称号，发表学术论文150余篇，获授权专利15项。
优先数字出版时间：2011-06-11，地址：wwwki/kcms/detail/52.1051.TS.20110611.0752.001.html?uid=。
功能菌株在白酒生产中的有效应用。上述系列研究成果已刊登于国际重要发酵食品相关期刊，现在国内发表的翻译稿基础上对近年来在该领域的研究成果进行介绍。1四甲基吡嗪概述
吡嗪是1、4位含2个氮原子的六元杂环化合物，广泛存在于天然或加工后的食品中，是一种分布广泛的杂环类化合物（图1A）。四甲基吡嗪，又名川芎嗪，是吡嗪环碳原子上均连接甲基的吡嗪类化合物（图1B），广泛存在于食品原料、加工食品和酒精饮料中[1]。它具有烘烤、花生、榛子和可可的香气，被认为是一类重要的香味化合物，常用于烘烤食品、冷饮、肉类、乳制品、卷烟等香精的调配[8]。除了作为食品风味添加剂的用途，四甲基吡嗪也是一种健康营养活性物质，它作为中药材川芎根茎的主要活性生物碱成分，能够扩张小动脉，改善微循环和脑血流，以及抗血小板聚集和解聚已聚集
的血小板，因此，具有心脑血管疾病的药理作用；另外，它对顺铂诱导的氧化应激、细胞凋亡和肾毒性均具有预防作用[3]。在中国的传统白酒中亦检测到一定量的四甲基吡嗪，因此，它不但对中国白酒的风味有重要的贡献，同时也赋予了中国白酒有益健康的功能。
2四甲基吡嗪的微生物来源[9-12]
周昌贡
对于中国白酒中的有益健康风味成分四甲基吡嗪，过去一直认为它是由还原糖类和氨基化合物之间发生的美拉德反应所产生。2007年，在“中国白酒169计划”的资助下，江南大学研究人员设计应用了内源性前体乙偶姻筛选策略，首次从酱香型白酒高温大曲中筛选获得了高产乙偶姻及四甲基吡嗪的芽孢杆菌，并建立了产四甲基吡嗪功能芽孢杆菌库。对其中的1株高产菌株，经过代谢调控技术与发酵控制技术的应用，四甲基吡嗪生产能力达到目前微生物发酵法生产领先水平。该菌株在营养肉汤琼脂平板上37℃培养，培养初期，菌落形态为灰，圆形，表面光滑有光泽，边缘整齐；后期为乳白，圆形，不透明，表面粗糙有皱褶，无光泽，边缘不整齐呈裂叶状并突起。在YPG液体培养基中培养的细胞经显微镜观察为革兰氏阳性，短杆菌，具芽孢；经扫描电镜观察，细胞呈杆状，周生鞭毛，无荚膜，细胞质均匀。根据菌落和细胞形态特征，结合生理生化特性以及16S rRNA基因序列比对分析，确定该菌为枯草芽孢杆菌。从该菌的发酵产物谱中共检出3种吡嗪类化合物，分别为三甲基吡嗪、四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪。
该系列研究已发表于国际重要发酵相关期刊上，并受到国内外同行的高度关注。该研究工作从实践上证明了中国白酒中四甲基吡嗪来源于为微生物的代谢反应，而非过去一度认为的美拉德反应。
3微生物发酵生产四甲基吡嗪的机制
3.1四甲基吡嗪前体物质的来源与产生机制[9-10]
以高产四甲基吡嗪的功能枯草芽孢杆菌为研究对象，江南大学研究人员跟踪了四甲基吡嗪的发酵过程，发现提高乙偶姻的合成能力以及添加铵盐都能够显著提高产物四甲基吡嗪的含量，该结果有效证明了乙偶姻和氨是微生物发酵生产四甲基吡嗪的前体物质，且两者共同作用生成了四甲基吡嗪。
研究过程在四甲基吡嗪枯草芽孢杆菌代谢产物谱中，检测到一定浓度的乙偶姻、四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪、2,3-丁二酮、2,3-丁二醇（两个异构体）、乙醇和乙酸乙酯等挥发性物质以及乳酸和乙酸等有机酸。通过对这些物质合成过程的跟踪以及同位素示踪等代谢工程技术的应用，确定了四甲基吡嗪前体物乙偶姻的生物合成途径为：糖酵解产生的丙酮酸，两分子丙酮酸缩合形成一分子α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸在α-乙酰乳酸脱羧酶的作用下脱羧形成乙偶姻，乙偶姻可与2,3-丁二醇、2,3-丁二酮等物质进行相互转化。
在对四甲基吡嗪前体氨的来源研究中，通过底物添加法以及同位素示踪法的应用，提出了中国白酒中
四甲基吡嗪的前体物氨可由多种来源产生，如氨基酸等。该结果也表明，在酿造体系中加入高产蛋白酶的菌株能够增加体系中的前体物氨，从而提高白酒中四甲基吡嗪的含量。
3.2前体物转化生成四甲基吡嗪的机制[10,13]
目前，微生物发酵体系乙偶姻和氨转化生成四甲基吡嗪的机制主要存在两种不同的观点，争论的核心问题在于发酵体系中乙偶姻和氨反应生成四甲基吡嗪的过程是否存在酶促催化反应。针对以上疑问，江南大学的研究人员采用原位反应模型和酶促反应模型对四甲基吡嗪的反应机制进行了研究，发现枯草芽孢杆菌胞内和胞外均不存在催化乙偶姻和氨反应生成四甲基吡嗪的相关酶，即枯草杆菌发酵体系中的四甲基吡嗪是由细胞的代谢产物乙偶姻和发酵环境中的氨发生非酶促反应产生的。
综合上述所有研究结果，江南大学提出了中国白酒中四甲基吡嗪的主要生成途径，如图2所示。
研究所提出的四甲基吡嗪产生机制，表明了在酿造
图1吡嗪和四甲基吡嗪的化学结构
图2枯草芽孢杆菌代谢产生乙偶姻以及
四甲基吡嗪生成的机制
中提高前体乙偶姻的产生以及氨的供应都能够促进四甲基吡嗪的合成，因此在酿造过程中如何调控这两种物质的产生是白酒生产中四甲基吡嗪合成的重要控制方向。4微生物生成四甲基吡嗪的发酵调控[14-16]
为了将功能菌株有效应用于中国白酒的酿造工艺中，以及应用于四甲基吡嗪产品的规模化生产，需要对菌株进行有效的发酵调控，以提高微生物发酵合成四甲基吡嗪的能力。微生物发酵生产四甲基吡嗪，主要受到微生物自身代谢的调控。为了提高微生物合成四甲基吡嗪的产量，江南大学研究人员做了很多工作，如优化发酵培养基成分、添加前体物质、调控发酵条件等，均取得到了明显的成效。研究人员对四甲基吡嗪的发酵合成过程进行了系统的分析，根据功能菌株在不同培养条件下的发酵动力学分析，建立了以下有效的调控策略：
①两阶段pH控制策略：控制培养前期的发酵液为弱酸性，保证细胞的增殖和前驱物质乙偶姻的大量积累，培养后期调节发酵液为中性，促进乙偶姻转化生成TTMP；②多阶段搅拌转速偶联温度控制的发酵策略；③葡萄糖和氨的补加策略。
通过以上发酵调控策略的应用，无论是在液态还是固态发酵中，四甲基吡嗪的生产能力均达到了国际领先水平。目前江南大学已将该功能菌株在一些酿酒企业进行了应用，明显提高了白酒中四甲基吡嗪的含量。
5国外对发酵食品中四甲基吡嗪产生的几种途径的研究[17-18]
四甲基吡嗪天然存在于可可制品、咖啡、乳制品、肉、花生、榛子、朗姆酒、威士忌酒和大豆制品等食品和酒精饮料中。作为一种健康的风味化合物，国外研究者对不同产品中四甲基吡嗪的来源也进行过研究。某些烘焙食品中的四甲基吡嗪主要来自于美拉德反应，但其他一些产品则主要来自于微生物代谢作用，如日本发酵食品“纳豆”，早在1962年，日本研究者就在纳豆中分离得到四甲基吡嗪，并且日本研究人员研究发现，其中的枯草芽孢杆菌具有发酵产生四甲基吡嗪的能力，证明了发酵食品纳豆中的四甲基吡嗪来自于微生物的代谢反应。1972年，又有研究者从发酵的可可豆中到了发酵产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌，并发现只有在枯草芽孢杆菌生长时，体系中才会有四甲基吡嗪产生，这也证明了发酵可可豆中的四甲基吡嗪也是由枯草芽孢杆菌产生的。
数量级6结语
对中国白酒酿造机制的理论认识、酿造工艺的现代化革新是中国白酒向国际领先水平迈进的重要标志。四甲基吡嗪是中国白酒中的重要风味物质，江南大学在“中国白酒169计划”资助下，对中国白酒中四甲基吡嗪的来源及产生机制进行了深入的研究，研究成果在国际上获得了高度认可。中国白酒中四甲基吡嗪的微生物来源体现了白酒功能微生物在白酒酿造中的重要作用，也体现了白酒功能微生物研究工作的重要价值。白酒功能微生物的研究不但能够更深入的理解中国白酒的酿造机制，而且有助于中国白酒酿造工艺的革新与白酒品质的提升。
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-------------------------------------------------贵州省白酒产业发展推进大会在仁怀市召开
本刊讯：2011年6月29日至6月30日，贵州省政府在中国酒都——
—仁怀市召开了全省白酒产业发展推进大会。省长赵克志出席会议并讲话，副省长孙国强主持会议，各市(州、地)、省有关部门、科研院所和部分县(市、区)负责人及有关白酒生产企业负责人等共计300人左右参加了会议。
6月29日下午，与会各代表参观了茅台酒厂、糊涂酒业公司和仁怀名酒工业园区坛厂酒类配套区。孙国强副省长在当地负责人及酒厂负责人的陪同下，兴致勃勃参观了糊涂酒业生产车间并品尝了酒窖中不同香型的酒；在参观茅台酒厂时，孙副省长认真听取了酒厂工作人员对茅台酒生产过程的讲解，并参观了茅台国酒文化城。
6月30日上午，会议在仁怀市隆重召开。省长赵克志出席会议并讲话。他强调，白酒产业是我省重要的支柱产业和特优势产业，抓工业必须抓白酒，实施工业强省战略首先要加快白酒产业发展。要按照总书记关于加快发展贵州特优势产业的重要指示精神，贯彻落实4月9日省委、省政府专题会议要求，围绕加速发展、加快转型、推动跨越的主基调，按照“解放思想、创新模式，高端引领、中低并举，以质取胜、打造品牌”的总体思路，坚持质量优先、以质取胜，高端引领、中低并举，酱浓并举、兼有其他，盘活存量、扩大总量，优化环境、扩大开放，生产百万千升白酒，打造千亿元级产业，推动白酒产业跨越式发展。到2015年，全省白酒产量确保80万千升，力争100万千升，占全国白酒市场份额的10%左右，白酒工业总产值确保1300亿元，力争1500亿元；培育一批名优品牌，新增6～10个中国驰名商标和一批著名商标。到2020年，占全国白酒市场的份额争取达到20%。同时，要加快把茅台酒打造成“世界蒸馏酒第一品牌”、把茅台镇打造成“中国国酒之心”、把仁怀市打造成“中国国酒文化之都”，实现“未来十年中国白酒看贵州”的奋斗目标。
副省长孙国强在主持会议时强调，各
地各有关部门要认真贯彻落实省委、省政
府关于加快白酒产业发展的有关要求和本
次会议精神，做到思想认识到位、组织领导
到位、政策措施落实到位、舆论宣传到位，
有机硅树脂合力推进我省白酒产业又好又快发展。
省经信委、遵义市政府、仁怀市政府、
贵州茅台酒厂（集团）有限公司、金士力酒
业有限公司、金沙窖酒酒业公司、青酒集团
有限公司等单位负责人在会上作了发言。
（萤子、赵静、伊廷金）赵克志省长在大会上讲话大会会场一隅40
豫公网安备41160202000603
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