凯氏定氮法
科技名词定义
中文名称：
凯氏定氮法
英文名称：
Kjeldahl determination
定义：
测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。 所属学科：
生物化学与分子生物学(一级学科) ；方法与技术(二级学科)
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原理
试剂
仪器
操作方法
计算
注意事项
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原理
蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
1.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成（NH4）2SO4
2NH2+H2S04+2H＝(NH4)2S04 （其中CuSO4做催化剂）
2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中
反应式为:
(NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO4
2NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O
3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量
反应式为：
(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O＝(NH4)2SO4+4H3BO3
(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3
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试剂
所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
2.2 硫酸钾。
2.3 硫酸。
2.4 2%硼酸溶液。
2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。
2.6 40%氢氧化钠溶液。
2.7 0.025mol/L硫酸标准溶液或0.05mol/L盐酸标准溶液。
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仪器
定氮蒸馏装置：如图所示。
凯氏定氮法仪器
1.路易十四时代安全管
2.能源与可持续发展导管
3.汽水分离管
4.样品入口
5.塞子
6.冷凝管
7.吸收瓶
8.隔热液套
9.反应管
10.蒸汽发生瓶
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操作方法
1、 样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100
ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。
2、 按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
3、 向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰或蓝紫为终点。
同时吸取vistabootpro10.0ml试剂空白消化液按3操作。
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计算
X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100%
X：样品中蛋白质的百分含量，g；
V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；
V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；
N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；
0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
m：样品的质量（体积），g（ml）；
F：氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为 5.30。
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注意事项
（1） 样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。
（2） 样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。
（3） 硝化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢（H2O2）2-3ml，促使氧化。
（4） 在整个消化过程中，不要用强火。保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。
（5） 如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。
（6） 加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反
应的指示剂。
（7） 混合指示剂在碱性溶液中呈绿，在中性溶液中呈灰，在酸性溶液中呈红。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。
（8） 氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。
（9） 吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。
（10） 以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。
（11） 向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深l蓝的结合物[Cu(NH3)4]2+
（12） 这种测算方法本质是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算。只有在被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量。
酶法回收虾头和虾壳中的蛋白质
利用蛋白酶水解虾壳和虾头,以水解度(DH%)和TCA可溶性氮为指标并结合感观评价,研究了各种条件对水解效果的影响。通过比较不同蛋白酶的水解效果,发现碱性蛋白酶的水解效果最好,最适的水解条件为:碱性蛋白酶添加量4IU/g,自然pH值,水解温度60℃,水解时间5～7h,固液比1∶10,风味蛋白酶(添加量13～65IU/g),于水解2h后加入,在此条件下,水解度达到20.7%,TCA可溶性氮达到42.0mg/mL,水解液无苦味和腥味,风味良好。 虾头的酶解
以南美白对虾的虾仁加工废弃物——虾头为原料,对其最佳作用酶及酶解工艺进行了研究,并分析了酶解前后各游离氨基酸含量。结果表明:在几种实验酶中酶解效果最好的是木瓜蛋白酶,其最适作用条件为物液比1:0.6,初始pH7.5、酶用量775U/g、温度42℃、酶解3h,此条件下对虾头蛋白的水解度可达到64.82%;为解决酶解物的苦味问题,将木瓜蛋白酶与复合风味酶1:1(质量比)复合后用酶总量775U/g,在木瓜蛋白酶的最适作用条件下酶解3h,酶解液无苦味且具诱人、浓郁的海虾风味,水解度为58.01%;与对虾头浆液相比,酶解液中各游离氨基酸含量均大大增加,其中谷氨酸增幅及含量均为最大。
以美拉德反应产物为香基的海鲜调味品研究
王智勇
【摘要】： 利用AS1.398中性蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶及木瓜蛋白酶对斑节对虾头蛋白进行酶水解试验，从中选出了优选试验用酶，并在此基础上对优选酶的最适酶解工艺条件进行了探讨。试验结果表明，AS1.398中性蛋白酶对对虾头的水解能力最强，胃蛋白酶次之，而木瓜蛋白酶与菠萝蛋白酶的水解能力最差。AS1.398中性蛋白酶酶解虾头蛋白的最佳工艺条件为：pH 7.0，温度45℃，时间7h，底物浓度8％，酶添加量2.2％(酶活力100000U／g)。 采用酸水解法研究华南地区来源丰富的木薯淀粉应用新领域。通过14(3~3)正交试验确定了木薯淀粉酸水解为还原性转化糖浆的理想条件：盐酸浓度2.0％(V／V)，水解温度80℃，淀粉乳浓度6g／100mL。 以木薯淀粉还原性转化糖浆(淀粉糖浆)及对虾头蛋白酶解液为主要反应基质，在单因子及多因子试验基础上，探索了获得美拉德反应产物—海鲜调味品香基的最佳反应工艺参数：温度90～100℃，pH6.5～8.5，时间50min，DE值85的淀粉糖浆，50％的氨基酸溶液(1 670mg／100mL)。 以美拉德反应产物(MRPs)为香基，添加调味品的主要辅助原料，通过L_8(2~7)及L_9(3~4)正交试验，探索获
得、香、味俱佳的海鲜调味晶配方工艺。试验结果表明，理想的调味品配方为：美拉德反应产物100份、食盐1.0份、白砂糖0.4份、柠檬酸0.5份、味精0.4份、香菇2.0份、胡椒0.1份、芝麻油0.2份、淀粉2.5份、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)1.0份、β—环糊精(β-CD)1.0份。
【关键词】：美拉德反应 斑节对虾头 木薯淀粉 海鲜调味品
影响美拉德反应的几种因素研究
吴惠玲 王志强 韩春 彭志妮 陈永泉
【摘要】：本文研究了加热温度、加热时间、反应体系pH、5种糖类及金属离子对美拉德颜反应的影响。实验表明在一定条件下,温度越高、时间越长美拉德反应的颜越深,pH低于7.0时反应不明显,当pH7.0时美拉德反应的速度加快。5种糖的反应活性依次为木糖﹥半乳糖﹥葡萄糖﹥果糖,蔗糖无明显反应。Fe3+、Fe2+农业机械学报能促进美拉德反应,且Fe3+比Fe2+更能促进反应颜的加深;Ca2+、Mg2+对美拉德反应起抑制作用,且Mg2+比分散剂Ca2+抑制作用强;K+对美拉德反应影响相对较小。
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