山东科学ＳＨＡＮＤＯＮＧＳＣＩＥＮＣＥ
第３３卷第４期２０２０年８月出版
Ｖｏｌ.３３Ｎｏ.４Ａｕｇ.２０２０ＤＯＩ:１０.３９７６/ｊ.ｉｓｓｎ.１００２￣４０２６.２０２０.０４.００１ʌ中药与天然活性产物ɔ
收稿日期:２０２０￣０２￣０５
基金项目：烟台市重点研发计划(２０１８ＺＤＣＸ０１４)ꎻ山东省农业重大应用技术创新项目ꎻ莱阳市新旧动能转换科技创新计划
作者简介：李玲玉(１９９６ )ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为农产品加工与贮藏研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｓｄｎｙｄｘｌｌｙ＠１６３.ｃｏｍ∗通信作者ꎬ郑振佳ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ研究方向为农产品加工与贮藏研究ꎮＴｅｌ:１８００１３０１３０３ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｚｈｅｎｇｚｈｅｎｊｉａ＠ｓｄａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ高效凝胶过滤谱法测定菊糖聚合度 李玲玉１ꎬ李雨晨２ꎬ左兆河３ꎬ田宝兰３ꎬ郑振佳１∗
(１.山东农业大学食品科学与工程学院山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室ꎬ山东泰安２７１
０１８ꎻ２.山东医药技师学院ꎬ山东泰安２７１０００ꎻ３.山东植益源健康科技有限公司ꎬ山东泰安２７１０００)
摘要：菊糖属于天然大分子多糖ꎬ其生理活性与性质受聚合度的影响ꎮ以ＯＨｐａｋＳＢ￣８０２.５ＨＱ为谱柱ꎬ进样量为２０μＬꎬ柱温为３０ħꎬ流动相为０.３ｍｏｌ/ＬＮａＮＯ３溶液ꎬ流速为０.３ｍＬ/ｍｉｎꎬ通过ＧＰＣ软件拟合三次方程标准曲线ꎬ利用高效凝胶谱方法检测了９个样品的分子量并计算了其聚合度ꎮ结果表明ꎬ９个样品的菊糖聚合度在１０~２９ꎬ同种原材料的不同批次和不同品种间聚合度均存在差异ꎮ该方法为分析样品中菊糖的结构性质及控制产品质量提供了参考依据ꎮ 石门一中苏光
关键词：菊糖ꎻ聚合度ꎻ高效凝胶过滤谱ꎻ多糖含量ꎻ相对分子量
中图分类号:Ｏ６５７.７㊀㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀㊀文章编号:１００２￣４０２６(２０２０)０４￣０００１￣０６
开放科学(资源服务)标识码(ＯＳＩＤ):
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｇｅｌｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｆｏｒｔｈｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｉｎｕｌｉｎｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ＬＩＬｉｎｇ￣ｙｕ１ꎬＬＩＹｕ￣ｃｈｅｎ２ꎬＺＵＯＺｈａｏ￣ｈｅ３ꎬＴＩＡＮｂａｏ￣ｌａｎ３ꎬＺＨＥＮＧＺｈｅｎ￣ｊｉａ１∗
(１.ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｏｏｄＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＱｕａｌｉｔｙＣｏｎｔｒｏｌｉｎＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅꎬＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＴａｉａｎ２７１０１８ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｈａｎｄｏｎｇＭｅｄｉｃｉｎｅＴｅｃｈｎｉｃｉａｎ
ＣｏｌｌｅｇｅꎬＴａｉａｎ２７１０００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＳｈａｎｄｏｎｇＺｈｉｙｉｙｕａｎＨｅａｌｔｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ.ꎬＬｔｄ.ꎬＴａｉａｎ２７１０００ꎬＣｈｉｎａ)ＡｂｓｔｒａｃｔʒＩｎｕｌｉｎｉｓａｔｙｐｅｏｆｎａｔｕｒａｌｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅａｎｄｉｔｓｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｒｅａｆｆｅｃｔｅｄｂｙｔｈｅｄｅｇｒｅｅｏｆｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬＯＨｐａｋＳＢ￣８０２.５ＨＱｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｌｕｍｎ.Ｔｈｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅｗａｓ２０μＬꎬｔｈｅｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ３０ħꎬｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｗａｓ０.３ｍｏＬ/ＬＮａＮＯ３ｓｏｌｕｔｉｏｎꎬａｎｄｔｈｅｆｌｏｗｒａｔｅｗ
ａｓ０.３ｍＬ/ｍｉｎ.ＴｈｅｃｕｂｉｃｅｑｕａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｗａｓｆｉｔｔｅｄｕｓｉｎｇＧＰＣｓｏｆｔｗａｒｅ.Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｓｏｆｎｉｎｅ
ｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｕｓｉｎｇｈｉｇｈ￣ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｇｅｌｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｔｈｅｄｅｇｒｅｅｏｆｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｗａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄ.Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｎｕｌｉｎｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｄｅｇｒｅｅｏｆｉｎｕｌｉｎｏｆｎｉｎｅｓａｍｐｌｅｓｒａｎｇｅｄｂｅｔｗｅｅｎ１０ａｎｄ２９ａｎｄｔｈｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｄｅｇｒｅｅｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂａｔｃｈｅｓａｎｄｖａｒｉｅｔｉｅｓｏｆｔｈｅｓａｍｅｒａｗｍａｔｅｒｉａｌｗｅｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔ.Ｔｈｅｐｒｏｐｏｓｅｄｍｅｔｈｏｄｐｒｏｖｉｄｅｓａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｑｕａｌｉｔｙｏｆｉｎｕｌｉｎ.
ＫｅｙｗｏｒｄｓʒｉｎｕｌｉｎꎻｄｅｇｒｅｅｏｆｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎꎻｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｇｅｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎻｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｃｏｎｔｅｎｔꎻｒｅｌａｔｉｖｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔCopyright©博看网 www.bookan. All Rights Reserved.
山㊀东㊀科㊀学２０２０年㊀㊀菊糖(ｉｎｕｌｉｎ)是一种直链结构多糖ꎬ由Ｄ￣呋喃果糖经β(２ң１)糖苷键聚合而成ꎬ其还原端末端带有一分子葡萄糖ꎬ聚合度在２~６０[１]ꎮ菊糖广泛分布于植物㊁微生物和真菌中ꎬ其中菊科和桔梗科植物中含量尤为丰富[２￣４]ꎮ菊糖具有降血糖㊁降血脂㊁调节肠道菌㊁抗癌等多种生理活性ꎬ同时也可作为天然质构剂应用于生产巧克力㊁奶酪㊁肉馅㊁面条等多种食品及菊糖系列保健品等诸多领域[５￣９]ꎮ研究发现菊糖的生理活性和加工特性与菊糖聚合度密切相关ꎮ例如ꎬＰａｄａｌｉｎｏ等[１０]发现与低聚合度的菊粉相比ꎬ在意大利面中添加高聚合度菊粉后ꎬ面条的总膳食纤维显著增加ꎬ有效碳水化合物和淀粉消化率含量降低ꎻＬｕｏ等[１１]发现高㊁中㊁低三种聚合度的菊粉均可以延缓淀粉的老化ꎬ但低聚合度菊粉效果最好ꎮ然而植物来源㊁收获季节㊁气候㊁土壤以及生产加工过程等各个因素均会对聚合度产生影响[１２]ꎮ高效凝胶谱法是利用凝胶粒径来排阻特定大小分子的方法ꎬ按照样品的分子量大小对其分级ꎬ大分子通过凝胶柱时被完全排阻在填料网孔之外先流出ꎬ小分子则穿过填料网孔溶剂中后流出[１３]ꎮ该方法具有高效㊁快速㊁灵敏度高等特点ꎬ目前常被用于研究多聚合物的相对分子量及分布的测定ꎬ逐渐应用于多糖㊁蛋白和树脂等多种聚合物中[１４]ꎮ本文建立了一套高效凝胶过滤谱测定相对分子量的方法ꎬ将系列不同分子量的葡聚糖样品配制后ꎬ进入高效凝胶谱系统ꎬ将测得的响应值和出峰时间的谱图用ＧＰＣ软件处理ꎬ绘制分子量和出峰时间关系曲线ꎬ并且利用该方法对菊苣㊁菊芋和牛蒡三种批次农产品提取的菊糖分子量进行检测ꎮ本研究为天然菊糖活性研究及菊糖产业化生产与市场开发奠定了基础ꎮ
１㊀仪器与材料１.１㊀仪器与试剂ＬＣ￣２０Ａ高效液相谱仪(日本岛津公司)ꎬ配有四元泵㊁示差检测器(ｒｅｆｒａｃｔｉｏｎｉｎｄｅｘｄｅｔｅｃｔｏｒ￣１０ＡꎬＲＩＤ￣１０Ａ)㊁柱温箱㊁自动进样器等ꎻＳＣＩＥＮＴＺ￣１２Ｎ冷冻干燥机(宁波新芝生物科技有限公司)ꎻＴ６新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)ꎮ
ＯＨｐａｋＳＢ￣８０２.５ＨＱ谱柱(８ｍｍˑ３００ｍｍꎬ６μｍꎬ日本Ｓｈｏｄｅｘ公司)ꎮ葡聚糖(３４２Ｄ㊁１０００Ｄꎬ２０００Ｄꎬ５０００Ｄꎬ６０００Ｄꎬ试剂纯ꎬ上海源叶生物公司)ꎻ无水乙醇㊁苯酚㊁正丁醇㊁硝酸钠㊁氯仿等(分析纯ꎬ天津市凯通化学试剂有限公司)ꎻ浓硫酸(优级纯ꎬ济南试剂总厂)ꎻ果糖(优级纯ꎬ北京索莱宝科技有限公司)ꎻ实验用水为娃哈哈纯净水ꎮ
经济分析１.２㊀实验材料菊芋㊁菊苣和牛蒡的干切片ꎬ分别编号为ａ㊁ｂ㊁ｃꎬ其中菊芋ａ￣１㊁ａ￣２和ａ￣３产地分别为江苏徐州㊁河北衡水和福建宁化ꎻ菊苣ｂ￣１㊁ｂ￣２和ｂ￣３产地均为吉林长白山ꎻ牛蒡ｃ￣１㊁ｃ￣２和ｃ￣３分别为江苏徐州的白肌㊁柳川理想和山东临沂的黑皮牛蒡ꎮ
２㊀方法与结果２.１㊀菊糖样品制备参照冯鑫等[１５]和Ｌｉａｏ等[１６]的实验方法提取菊糖ꎮ分别将购买的９个样品的干切片干燥至恒质量ꎬ粉碎后过８０目筛ꎬ备用ꎮ准确称取样品１００ｇ于烧杯中ꎬ加入１０倍体积的８５％乙醇溶液ꎬ磁力搅拌５ｈꎬ离心(５０００ｒ/ｍｉｎꎬ１５ｍｉｎ)去除乙醇ꎮ将样品中加入３０倍体积的超纯水ꎬ在７０ħ水浴锅中浸提２ｈꎮ将浸提液离心㊁抽滤后用旋转蒸发仪
浓缩至原体积的１/３ꎬ向其中加入４倍体积的Ｓｅｖａｇｅ试剂(Ｖ(氯仿):Ｖ(正丁醇)＝１:４)ꎬ磁力搅拌器搅拌３０ｍｉｎꎬ离心后取上层糖液ꎬ重复上述步骤３次ꎮ溶液经上述步骤处理后ꎬ加入４倍体积的无水乙醇ꎬ４ħ下静置过夜ꎬ离心后将沉淀冷冻干燥ꎬ得到粗菊糖ꎮ
２.２㊀菊糖质量分数的测定以果糖为标准对照糖ꎬ采用苯酚￣硫酸法测定样品中多糖质量分数[１７￣１９]ꎮ以果糖浓度(μｇ/ｍＬ)为横坐２Copyright©博看网 www.bookan. All Rights Reserved.
第４期李玲玉ꎬ等：高效凝胶过滤谱法测定菊糖聚合度
标ꎬ吸光度ＯＤ４９０ｎｍ为纵坐标ꎬ绘制果糖标准曲线ꎮ标准曲线为Ｙ＝０.００７４Ｘ－０.００２３ꎬＲ２＝０.９９９４ꎬ糖浓度在２０~１００μｇ/ｍＬ时与吸光度具有良好的线性关系ꎮ２.３㊀分子量的测定参照李琬聪等[２０]和Ｃｈｅｎ等[２１]的方法测定菊糖分子量ꎮ
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２.３.１㊀高效液相谱条件谱柱：凝胶谱柱ＯＨｐａｋＳＢ￣８０２.５ＨＱ(８ｍｍˑ３００ｍｍꎬ６μｍ)ꎻ示差折光检测器:ＲＩＤ￣１０Ａꎻ进样量:２０μＬꎻ柱温:３０ħꎻ流动相０.３ｍｏｌ/Ｌ硝酸钠溶液和水ꎬ以０.３ｍＬ/ｍｉｎ的流速对菊糖样品ｃ￣１进行分析ꎬ液相谱图见图
１ꎮ
图１㊀ｃ￣１样品高效液相谱图
Ｆｉｇ.１㊀ＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｆｃ￣１诺顿2013
２.３.２㊀标准曲线的拟合本研究考察了一次方程到五次方程的拟合形式ꎬ用标准曲线的Ｒ２值为衡量标准ꎮ依据２.３.１高效液相谱条件进样ꎬ分别配制５.０ｍｇ/ｍＬ的葡聚糖(分子量为６０００Ｄ㊁４０００Ｄ㊁２０００Ｄ㊁１０００Ｄ和３４２Ｄ)ꎬ并用０.２２μｍ的水系滤头过滤ꎬ拟合标准曲线为Ｙ＝－０.００１７１８１５７Ｘ３＋０.１５０４５６１Ｘ２－４.４９８４８４Ｘ＋４８.７１８７４ꎬＲ２＝０ ９９９９ꎬ见图２ꎮ
图２㊀不同分子量糖标准曲线
Ｆｉｇ.２㊀Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆｄｅｘｔｒａｎｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｓ
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山㊀东㊀科㊀学２０２０年
２.３.３㊀菊糖聚合度测定将样品配制为５.０ｍｇ/ｍＬꎬ使用０.２２μｍ的水系滤头过滤ꎮ按照标准样
品的条件进样ꎬ获得样品的出峰时间和强度分布图ꎬ将该结果带入ＧＰＣ软件拟合的标准曲线中计算菊糖相对分子质量ꎬ进而检测菊糖聚合度ꎮ
２.４㊀方法学考察２.４.１㊀准确性取葡聚糖对照品(３４２Ｄ㊁２０００Ｄ和６０００Ｄ)各３份ꎬ按照１.３.３的处理方法ꎬ重复进样３次ꎬ将ＧＰＣ软件计算得到的相对分子质量与已知标准分子质量的葡聚糖为对照ꎬ利用相对误差衡量标准曲线的准确度ꎮ将保留时间带入ＧＰＣ软件拟合的标准曲线中ꎬ可得葡聚糖对照品(３４２Ｄ)的相对分子量分别为３４２Ｄ㊁３４３Ｄ和３４４Ｄꎬ相对误差分别为０㊁０.２９％和０.５８％ꎻ葡聚糖对照品(２０００Ｄ)的分子量分别为１９８９Ｄ㊁１９９３Ｄ和２００３Ｄꎬ相对误差分别为０.５５％㊁０.３５％和０.１５％ꎻ葡聚糖对照品(６０００Ｄ)的分子量分别为５９７２Ｄ㊁６０１３Ｄ和６０４４Ｄꎬ相对误差分别为０.４７％㊁０.２２％和０.７３％ꎬ说明该葡聚糖对照品准确度较好ꎮ２.４.２㊀重复性取多糖样品(ａ￣１㊁ｂ￣２和ｃ￣３)各３份ꎬ按照１.３.３的处理方法ꎬ重复进样３次ꎬ将测得的３组菊糖保留时间代入标准曲线ꎬ分别计算三种样品重均分子量的相对标准偏差ꎮ根据ＧＰＣ软件计算得到多糖样品的重均分子量ꎮ其中ａ￣１的相对分子量为１７６２Ｄ㊁１７８６Ｄ和１７９１Ｄꎬ平均值为１７８０Ｄꎬ相对标准偏差为０.８７％ꎻｂ￣２为３９９２Ｄ㊁４０００Ｄ和３９９６Ｄꎬ平均值为３９９６Ｄꎬ相对标准偏差为０.０１％ꎻｃ￣３为２２９０Ｄ㊁２２９６Ｄ和２２９４Ｄꎬ平均值为２２９３Ｄꎬ相对标准偏差为０.１３％ꎬ说明重复性良好ꎮ
２.５㊀数据处理
本实验采用ＧＰＣ软件计算多糖的平均分子量Ｍｗꎬ重复３次ꎬ并按照公式(Ｍｗ＝１６２ＤＰ＋１８)[２２]ꎬ计算菊
糖聚合度ꎮ利用Ｅｘｃｅｌ２０１６和Ｏｒｉｇｉｎ９.０进行数据处理ꎮ采用建立的测定方法分别分析了９批植物样品的多糖质量分数和相对分子量ꎬ并计算得到９批样品的聚合度ꎬ结果见表１ꎮ结果显示ꎬ本次选取的９个样品的菊糖聚合度在１０~２９ꎬ不同品种ꎬ同一品种不同批次菊糖聚合度均有不同程度的差异ꎮ
表１㊀菊糖聚合度及多糖质量分数
ａ￣２
５７.６９１９９７１２.２２ａ￣３６４.５０２６３７１６.１７ｂ￣１６９.８５２８９６１７.７７ｂ￣２６３.１６３９９６２４.５４ｂ￣３６８.６３４３７３２６.８８ｃ￣１６８.７５４６３９２８.５２ｃ￣２５７.５６４１７６２５.６７ｃ￣３５９.２７２２９３１４.０４
３㊀讨论与结论３.１㊀讨论３.１.１㊀流动相的选择从图１中ｃ￣１样品分子量液相图可以看出ꎬ以０.３ｍｏｌ/Ｌ硝酸钠溶液(ａ)和纯水作流动相(ｂ)出峰时间４Copyright©博看网 www.bookan.
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第４期李玲玉ꎬ等：高效凝胶过滤谱法测定菊糖聚合度和响应值差别不大ꎬ峰面积的相对标准偏差控制在１０％以内(相对标准偏差为９.４１％)ꎬ但前者作流动相测定菊糖分子量基线更为平稳ꎬ后者会出现基线漂移ꎬ因此该方法选用０.３ｍｏｌ/Ｌ硝酸钠溶液为流动相ꎮ３.１.２㊀流速的选择菊糖分析过程可通过降低流速实现提高分离效果的目的ꎬ同时流速的降低也会使峰宽增大造成保留时间变长[２３]ꎮ该谱柱在盐浓度０.２~０.５ｍｏｌ/Ｌ时ꎬ置换流量为０.３ｍＬ/ｍｉｎꎬ该流速下目标组分分离效果较好ꎬ因此选择０.３ｍＬ/ｍｉｎ的流速为分析流速ꎮ
３.１.３㊀标准曲线拟合形式的选择分别考察了一次到五次方程拟合的标准曲线ꎬ结果显示三次方程拟合的标准曲线拟合度最好ꎬ满足分析要求ꎬ相关系数Ｒ２>０.９９９ꎬ其他幂次拟合的方程Ｒ２值低于０.９８ꎬ可行性低于三次方程拟合ꎬ因此选择三次方程拟合标准曲线ꎮ
３.２㊀结论本研究建立了一套菊糖分子量的检测方法ꎬ其中谱柱为ＯＨｐａｋＳＢ￣８０２.５ＨＱꎬ进样量为２０μＬꎬ温度３０ħꎬ流动相为０.３ｍｏｌ/Ｌ硝酸钠溶液ꎬ流速为０.３ｍＬ/ｍｉｎꎬ利用ＧＰＣ软件绘制三次标准曲线及计算分子量ꎮ本研究从３种菊科植物３个批次提取的菊糖分子量检测结果看ꎬ９个样品聚合度有不同程度的差异ꎬ不同品种及同一品种不同批次即使在提取条件完全相同时菊糖的聚合度也会不同ꎬ同时本研究建立的方法的相对误差和相对标准偏差分别控制在０.７３％和０.
８７％ꎬ准确性和重复性较好ꎮ该方法可以直接应用到菊糖实际生产中ꎬ为后期功能性菊糖的开发及品质控制㊁食品工业上菊糖作为添加剂的筛选㊁不同产地或不同品种菊科植物产品的开发㊁不同储藏期菊糖分子量的研究等提供新思路ꎮ
参考文献:
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