[实验目的]
2.观察微丝在培养细胞中的形态及分布方式
3.了解细胞骨架成分显方法的原理及操作步骤
[实验原理]
细胞骨架是真核细胞胞质中由微丝，微管中间纤维等交织形成的纵横交错的立体纤维网络结构，对细胞形状的保持，细胞内物质运输，细胞运动，细胞内各结构相对位置的固定等有重要作用。微丝微管和中间纤维是根据纤维直径，组成成分或组装结构的不同划分的，均由单体蛋白以较弱的非共价键结合在一起构成纤维性多聚体，很容易进行组装和去组装。
微丝微管中间纤维等都是直径很小的结构，最大的单根微管才35nm左右，只有在电镜下才能看见。目前观察真核细胞中细胞骨架的主要方法有电镜，间接免疫荧光技术，酶标和组织化学等。常用的显示细胞骨架成分的特异性方法有1.特异性的药物结合反应（如罗丹明标记的鬼笔环肽）2.免疫细胞化学的方法制备细胞骨架蛋白的特异性抗体，用免疫荧光，免疫酶标的方法显示细胞骨架一水硫酸锌
鬼笔环肽为连环七肽，是从毒性萜类中分离出的剧毒生物碱，与聚合的微丝具有强亲和力，可抑制微丝的解聚，使微丝保持温度状态，用荧光标记物标记的鬼笔环肽在荧光显微镜下清晰显示微丝的分布
kuhle
采用微管蛋白单克隆抗体作为第一抗体与细胞内的微管蛋白结合，再用荧光素标记的抗产生微管蛋白的抗体的第二抗体结合，就可用荧光显微镜观察微管的存在状态。
家禽网[实演器材]
1.材料：体外培养的贴壁生长细胞
2.试剂：PBS溶液，小鼠抗人微管的单克隆抗体，FITC标记的羊抗鼠荧光抗体，
BSA封闭液，含有DAPI的防荧光淬灭剂，4%多聚甲醛，Trition X-100溶液3.设备：细胞培养设备，倒置显微镜恒温箱显微镜培养皿镊子吸水纸
[实验步骤]
1.细胞培养在盖玻片上，至70-80%融汇度
2.取细胞爬片，用PBS洗涤2次，每次10min勿震荡。eph
3.吸弃PBS缓冲液，用4%多聚甲醛室温固定5-10min
杨宗胜4.吸弃固定液，用PBS洗涤3次，每次10min
5.吸弃PBS缓冲液，用0.1%Trition X-100 PBS溶液室温处理5-10min
6.用PBS洗涤3次，每次10min
7.用吸水纸吸去盖玻片上的液体，在盖玻片上滴加20ul2%BSA封闭液，密闭湿盒中封闭30-60min
8.用吸水纸吸去盖玻片上的封闭液，在盖玻片上滴加20ul的小鼠抗人单克隆抗体，盖上盖玻片，密闭湿盒中37℃孵育30min
9. 用吸水纸吸去盖玻片冲掉，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5-10min
10. 用吸水纸吸去盖玻片上的一抗液，在盖玻片上滴加20ul的FITC标记的二抗溶液，盖上盖玻片，密闭湿盒中37℃孵育30min
11. 用PBS将无细胞的盖玻片冲掉，用PBS缓冲液洗涤3次，每次10min
12. 用吸水纸吸去盖玻片上的液体，滴加5ul含DAPI的防荧光淬灭剂，将盖玻片有细胞的一面朝下，轻
轻盖于含有防荧光淬灭剂的载玻片上，避免产生气泡13. 至于荧光显微镜下观察（FITC用蓝光激发观察绿荧光，细胞核经DAPI 染后用紫外光激发，产生蓝荧光）
[结果的分析与记录]
可以看出在第一张图片中，绿荧光比较多，几乎是成片出现，可能是因为二抗加的过多，并且在洗涤过程中可能没有洗干净，所以导致绿成片出现。但是第二次的图片中，很明显右下角的细胞基本没有染上绿的。原因可能是没有被一抗二抗结合，可能是处理时间不够，导致温育时细胞没有被抗体结合，或者是一抗或者二抗液加少了，并没有完全将细胞覆盖，所以有一部分未曾结合因而不显。
第一次世界大战地图我认为第二张图片左上部分的染还是很完美的。
如果有机会可以试着增加处理时间，看会不会一抗二抗结合的更好，细胞骨架能更好的显示出来。
[思考题]
1. 用1%Triton x-100处理细胞，有什么作用
用1%Triton x 100处理细胞可以除去细胞的质膜和内膜系统。在进行细胞骨架染时，可以使得荧光染料能够更容易地透过细胞膜与Factin特异性结合。以便于对细胞骨架显示和微丝的观察。
2. M缓冲液的作用是什么？
M缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定，可以提高细胞骨架的稳定性。在M缓冲液中，其中咪唑是缓冲剂EGTA 和EDTA螯合 Ca离子，溶液并提供Mg离子，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察。
3.如果使用的抗体浓度越高，温育时间越长，是否免疫荧光图像会更清晰？
不会，即使温育时间再长，微管上所能结合的抗体有限，所以最多只能达到一个顶峰值然后不会再有增长。
4. 微丝微管在不同分裂时期的分布有何不同
在分裂过程中，微管主要以纺锤丝存在，变化就是纺锤丝从细胞两极不断延伸，形成动粒微管和极微管，将染体拉向细胞两极。所以微管的位置一直在细胞两级。微丝可以形成细胞分裂环，参与细胞分裂，因此微丝基本在细胞中央位置。
5. 试分别用细胞松弛素B和秋水仙酰胺在37℃下处理培养的细胞2h，然后按前述方法做考马斯亮蓝染，细胞内纤维形态有何变化？
细胞松弛素B的作用是抑制微丝的生成，而秋水仙酰胺则是抑制细胞的有丝分裂，使细胞停止于分裂中期，为作用于M期的细胞周期特异物。因此用他们
处理细胞之后，细胞有丝分裂会停止，因此可能会观察到细胞中的微丝微管会处于他们在不同有丝分裂阶段的位置，可能会有部分增加，但是并不是所有细胞都会处于异常状态，可能还有部分正常细胞。
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