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鼻息肉炎症微环境中IGG4与STAT5b高表达

第29卷第5期中国组织化学与细胞化学杂志Vol.29.No.5 2020年10月CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY October.2020鼻息肉炎症微环境中IGG4与STAT5b高表达

李小怀蔦叶惠平2*

（1贵州省贵州医科大学；2贵州省人民医院耳鼻喉科，贵阳550025）〔摘要〕目的探究鼻息肉的病理微环境以及对病理微环境中的免疫细胞是否招募和炎症因子水平变化进行明确，并初步探讨IGG4和STAT5b在鼻息肉中高表达的临床意义。方法收集的临床正常鼻甲和鼻息肉组织进行石蜡和OCT包埋，制作石蜡切片和冰冻切片；采用石蜡切片进行常规病理染；利用冰冻切片对IGG4与STAT5b在正常鼻甲和鼻息肉中的表达进行免疫荧光定位；提取正常鼻甲和鼻息肉组织蛋白，对IGG4与STAT5b水平进行Western blot检测；同时对鼻息肉病理微环境中的中性粒细胞和巨噬细胞进行免疫荧光检测，并采用PCR检测正常鼻甲和鼻息肉中炎症因子TNF-a，IL-邛，IL-6的mRNA水平。结果相对于正常鼻甲组织，鼻息肉病理组织中呈现纤维化状态，且IGG4与STAT5b水平在鼻息肉中明显升高，此外，鼻息肉病理微环境中的中性粒细胞和巨噬细胞呈现招募趋势，且炎症因子TNF-a，IL-邛，IL-6的mRNA水平显著升高。结论鼻息肉的病理特征呈现纤维化状态，其病理微环境呈现炎症化；鼻息肉中高水平的IGG4与STAT5b可能促进鼻息肉癌变。

〔关键词〕鼻息肉；炎症；IGG4；STAT5b；免疫细胞

〔中图分类号〕R765.25〔文献标识码〕A DOI:10.16705/jki.1004-1850.2020.05.002

The high expression of IGG4and STAT5b in the inflammatory microenvironment

盐酸储罐of nasal polyps

Li Xiaohuai1,Ye Huiping2*

f Guizhou Medical University,Guizhou Province;2Department of Otolaryngology,Guizhou Provincial People s Hospital,Guiyang

550025,China）

〔Abstract〕Objective To explore the pathological microenvironment of nasal polyps and clarify whether the immune cells are recruited and the changes of inflammatory factor levels in the pathological microenvironment,and preliminarily explore the clinical significance of high expression of IGG4and STAT5b in nasal polyps.Methods The collected clinical normal turbinate and nasal polyp tissues were embedded in paraffin and OCT to make paraffin sections and frozen sections;paraffin sections were used for routine pathological staining;frozen sections were used to analyze the expression of IGG4and STAT5b in normal turbinates and nasal polyps by immunofluorescence locali

结题报告

zation;Western blot experiment was performed on the protein extracted from normal turbinate and nasal polyp tissues to quantify the expression of IGG4and STAT5b in normal turbinate and nasal polyps;at the same time,immunofluorescence localization was used to visualize the neutrophils and macrophages in the pathological microenvironment of nasal polyps,and PCR was used to detect the changes in the levels of inflammatory factors TNF-a,IL-1p,and IL-6in normal turbinates and nasal polyps.Results Compared with normal turbinate tissues,the pathological tissues of nasal polyps showed fibrosis,and IGG4and STAT5b were highly expressed in nasal polyps.In addition,neutrophils and macrophages in the pathological microenvironment of nasal polyps showed a tendency to recruit.The mRNA levels of inflammatory factors TNF-a,IL-1p,and IL-6were significantly increased.Conclusion The pathological characteristic of nasal polyps is fibrosis,and the pathological microenvironment is inflammatory.IGG4and STAT5b are highly expressed in nasal polyps,which may promote the potential carcinogenesis of nasal polyps.救国论坛

〔Keywords〕Nasal polyps;inflammation;IGG4;STAT5b;immune cells

鼻息肉病是一种以鼻黏膜的良性增生改变为特

（收稿日期）2020-08-06（修回日期）2020-10-10

（作者简介）李小怀，女（1990年），汉族，硕士在读

；通讯作者（To whom correspondence should be addressed）:

*****************征的疾病，在人中比较常见。2012年欧洲关于鼻窦炎和鼻息肉的诊疗指南指出，鼻息肉由于缺乏特征性的蛋白标志物诊疗证据，导致鼻息肉在欧洲国家很难在早期诊断［1］。有报道指出，欧盟11%的人口受慢性鼻窦炎的影响，给卫生系统和经济系统带来了严重负担。由于鼻息肉只是鼻窦疾病的病理内

404中国组织化学与细胞化学杂志第29卷

镜描述，因此，目前鼻息肉病尚无明确的诊断标准。此外，鼻息肉的病因目前尚不清楚，只能通过几种病理生理学特征来解释。这些不确定性因素限制了我们治愈鼻息肉的能力。尽管有些鼻息肉患者没有明显的特异性鼻息肉症状，但会伴随出现一系列并发症状，包括鼻塞、鼻涕、鼻塞和嗅觉缺失等，严重的会导致老年痴呆［2-4］。

IgG4相关性疾病是一种与淋巴细胞密切相关的慢性系统性疾病，该类疾病以血清IgG4水平升高以及IgG4阳性细胞浸润多种器官和组织为特征［5］。此外，STAT5是信号转导及转录激活因子家族中的重要一员，STAT5b是其中一个亚型，研究发现它的异常激活和过度表达能诱发肿瘤的形成［6］。为

了为鼻息肉的临床诊断提供一定依据，并为后期研究鼻息肉的发病机制打下基础，在本研究中我们观察了鼻息肉的病理特征，检测了鼻息肉中IGG4与STAT5b 水平，同时对鼻息肉病理微环境中的免疫细胞是否招募进行了分析。

材料和方法

1材料和试剂

20例正常鼻甲组织及20例鼻息肉组织均取自贵州医科大学省人民附属医院病理科。IGG4、STAT 5b、GAPDH、LY-6G与F4/80兔抗人多克隆抗体由美国Bioworld公司提供；488标记的山羊抗兔IgG （美国Gibco，SA00003-2），594标记的山羊抗兔IgG（美国Gibco，SA00043-8），山羊封闭血清、OCT冰冻包埋剂、苏木精、伊红、HistoChoice透明剂、中性树胶（Gibco）、牛血清蛋白（BSA）均购自百奥斯生物科技公司；多聚甲醛、抗荧光猝灭剂、Dulbecco's phosphate buffered saline（D-PBS）、无水酒精、Triton X-100原液等其常规试剂均为国产分析纯。

2标本制备

盖茂森正常鼻甲和鼻息肉组织OCT冰冻包埋，液氮速冻1h，-80°C冰箱冷冻48h，莱卡冰冻切片机制作8gm厚切片，正电荷防脱载玻片吸附冰冻切片，-20°C冰箱中冷冻保存备用。

3常规病理染

鼻息肉组织切片用经典的苏木素伊红染，用中性树胶固定，然后在奥林巴斯数字显微镜下观察。4免疫荧光染

冰冻切片自然晾干30min后，用0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH7.2~7.4）配制的4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗3次，1%Triton X100透膜20min，滴加含3%牛血清蛋白（BSA）和含10%正常山羊血清的PBS各250皿，湿盒内4°C下孵育1h；轻轻倒去孵育液，然后滴加一抗（1:150），以PBS代替一抗做阴性对照，4C湿盒孵育过夜；PBS清洗3次，滴加荧光二抗（1:200）及DAPI（百奥莱博，HR0453,1:500）,4C湿盒避光孵育1h；PBS冲洗3次，抗荧光猝灭剂封片，蔡司倒置荧光显微镜观察和拍照。

5蛋白质提取和印迹分析

在RIPA缓冲液（1%TritonX-100、15mmol/l NaCl，5mmol/l EDTA和10mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，按照蛋白提取流程，对组织蛋白进行提取和制备，然后通过10%SDS-PAGE进行蛋白分离，电泳转移到PVDF膜上，随后将PVDF膜放入5%脱脂牛奶中封闭2h，继而在室温下与以下主要抗体一起孵育：抗IGG4、抗Stat5b和抗GAPDH,4C孵育过夜，PBST 清洗3次，每次10min，继而进行二抗孵育2h，最后PBST清洗3次，每次10min。根据抗体生产商的说明，

使用增强型化学发光检测系统进行显、

检测。GAPDH作为内参蛋白。

6实时荧光定量RT-PCR

PCR引物序列参考文献或在PubMed上设计，

全长比对并确定序列准确无误，由Invitrogen公司合成，用DEPC水稀释后，置于-80C冰箱保存待用。PCR检测正常鼻甲和鼻息肉组织中炎症因子TNF-a,IL-1p,IL-6的mRNA的表达：Trizol法提取组织中的总RNA，反转录为cDNA后进行聚合酶链反应。内参采用GAPDH，其引物序列：上游5'-AT-TACGGCACAGTCAAGG-3'，下游5'-GCAGAAG-GGGGGAGATGA-3'。目的片段引物如下：IL-6上游5'-AGAGTCCATCCAGTTGCC-3'，下游5'-CCG-GACTTGTGAAGGGAA-3'；TNF-a上游5'-AC-CGTCCGATTTGCTAT-3'，下游5'-CCGGACTCCG-CGTCTAA-3'；IL-1p上游5'-GTTGCCAAGCCT-TATCG-3'，下游5'-TTCTTCTCACCCAGGGA-3'。用SYBR Green Master Mix（Qiagen）进行实时定量

第5期李小怀等.鼻息肉炎症微环境中IGG4与STAT5b高表达405

PCR反应（Bio-radCFX96Touch，美国Bio-Rad公司）。在95°C下引发15min，然后将样品分别在94°

C 进行5s,65°C进行45s和75°C进行90s，分别运行60个循环。所有样品均重复5次。计算方法：每个基因的CT值都取三个复孔的平均值，以GAPDH为内参基因来计算PCR模板的拷贝数，AACt目的基因=实验组减去对照组目的基因ACt值，采用2-AACt 方法计算。

7统计分析

数据表示为来自3个独立实验的平均值士标准误。用Student's t检验进行统计分析。多重比较由ANOVA进行评估，P<0.05被认为差异具有显著性。

结果

通过常规病理染，我们发现正常鼻甲组织中存在大量的腺体成分，这些鼻甲粘膜中的腺体可以起到调节吸入空气的温度、湿度、滤过和清洁作用，尤其是调节吸入空气的湿度。在鼻息肉组织中，我们发现鼻粘膜腺体成分大量减少，同时还发现鼻息肉呈现纤维化的病理状态（图1）。总之，常规病理染的结果揭示了鼻息肉的病理呈现纤维化以及伴随腺体减少的特征。

图1正常鼻甲与鼻息肉组织的HE染结果。A，正常鼻甲；B，鼻息肉；比例尺，100pm

Fig.1The HE staining results of normal turbinate and nasal polyp al turbinate tissue.B.nasal polyp tissue.Scale bar,100p m

IGG4过度表达可以加重纤维化的程度，造成多个器官和系统的器官肿大，组织破坏，甚至器官功能衰竭。而Stat5b的过度表达可以加重组织炎症损伤程度。为了明确这两个蛋白在鼻息肉组织病理变化的关系，应用免疫荧光染技术检测了IGG4与Stat5b在正常鼻甲和鼻息肉组织中的定位和表达。对比正常鼻甲组织，鼻息肉中IGG4与Stat5b免疫反应性均明显增强，并且一部分Stat5b表达在鼻息肉组织细胞核中（图2A和B）。此外，我们对正常鼻甲与鼻息肉组织的组织蛋白进行免疫印迹检测显示，鼻息肉组织中IGG4与Stat5b水平均明显高于正常鼻甲组织（图2C），表明鼻息肉组织中呈现特异性高表达IGG4与Stat5b的微环境。

Stat5b在鼻息肉组织中高表达，因此，我们推测鼻息肉组织所处的微环境很大程度上是一个炎症微环境，即多种免疫细胞招募，多种炎症细胞因子富集的微环境。我们采用LY-6G与F4/80分别标记正常鼻甲与鼻息肉组织中的中性粒细胞和巨噬细胞，结果发现中性粒细胞和巨噬细胞在鼻息肉组织中均出现了大量招募（图3A和B）。此外，我们对正常鼻甲与鼻息肉组织中TNF-a,IL-1p,IL-6炎症细胞因子进行PCR检测，结果正如预期的那样，相对于正常鼻甲组织，TNF-a、IL-1p和IL-6的mRNA水平在鼻息肉组织中较正常鼻甲中显著增加（图3C）o 以上结果表明，鼻息肉组织处在一个多种炎症细胞募集以及富集多种炎症细胞因子的病理微环境。

讨论

目前，从临床的发病病理特征来区分，鼻息肉可以分类为3种。第一种为局限性鼻息肉。研究发现单侧鼻息肉应高度怀疑鼻腔恶性肿瘤，尤其是经常接触木尘的老年人[7]o第二种为弥漫性鼻息肉病-慢性鼻窦炎伴鼻息肉，此型的鼻息肉常与慢性鼻窦炎有关，慢性鼻窦炎分有息肉（CRSwNP）和无息肉（CRSsNP）两型，基本上是基于鼻内镜检查中是否存在鼻息肉、炎症以及哮喘等加重呼吸

系统症状

406中国组织化学与细胞化学杂志第29卷

Merge B Stat5b DAPI Merge C1

IGG4

Stat5b

GAPDH

300-1

200J

A打针天地

系

旳

浪

茯

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正常鼻甲鼻息肉

正常鼻甲鼻息肉C3

***

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出«

150

正常鼻甲肉

息

图2IGG4与Stat5b在正常鼻甲与鼻息肉组织中的表达。A和B，正常鼻甲与鼻息肉组织中IGG4(A)和Stat5b(B)免疫反应性的免疫荧光检测的代表性图像；标尺，100pm。C，正常鼻甲与鼻息肉组织中测IGG4与Stat5b水平Western blot检测代表性结果(C1)和统计学分析(C2和C3)；***,P<0.001；n=10

Fig.2Expressions of IGG4and Stat5b in normal turbinates and nasal polyps.A and B,representative images of IGG4(A)and Stat5b(B)detected by immunofluorescence in normal turbinate and nasal polyp tissues;scale bar,100pm.C,representative results(C1)and statistical analyses(C2and C3)of the expression levels of IGG4and Stat5b in normal turbinate and nasal polyp tissues detected by Western blot(n=10);***,P<0.001

的共病［8］；此外，研究还发现嗜酸性粒细胞增多会加剧CRSwNP的炎症过程［9］。第三种为全身性鼻息肉病：丘格-施特劳斯综合征和囊性纤维化是伴有鼻息肉的两大常见系统性疾病。研究发现，高

达76%的丘格-施特劳斯综合征患者可发生鼻息肉，此外鼻息肉和抗中性粒细胞胞浆抗体阳性的患者应怀疑为影响小血管壁的坏死性肉芽肿性血管炎［10］。研究发现，在高达45%的囊性纤维化患者中发现鼻息肉，这类鼻息肉体检和病理检查发现发汗试验阳性，同时鼻窦CT完全浑浊，额窦和蝶窦发育不全的年轻患者应怀疑囊性纤维化［11］。另外，在丘格-施特劳斯综合征和囊性纤维化这些全身性疾病后，鼻息肉症状会有所缓解［12］。

目前，不断有新的研究尝试从广谱的病因和病理生理学方面解释这种异质性疾病的复杂性。在英国，根据临床参数选择特定的患者，取材进行细胞因子测定和炎症信号通路分析，旨在确定慢性鼻窦炎的生物标志物。进一步了解CRSwNP分型可以识别不同的患病人，有助于提供个性化的医疗服务。虽然可能无法治愈CRSwNP，但可以将当前管理方案中的不确定因素降至最低。目前可用于鼻息肉的方法主要基于临床经验，常用方法s包括阿司匹林/水杨酸脱敏疗法、大剂量鼻内或口服皮质类固醇、大环内酯类抗生素、生物制剂如奥马丽珠单抗以及鼻窦手术等，但这些方法没有循证医学的支持。在我们完全理解疾病的潜在机制之前，我们只能对症处

理

第5期李小怀等.鼻息肉炎症微环境中IGG4与STAT5b高表达407 A1LY-6G DAPI Merge

EE-*

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F4/80DAPI Merge A2

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LL.N

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正常鼻甲鼻息肉正常鼻甲鼻息肉正常鼻甲

共产主义原理

图3鼻息肉组织中中性粒细胞与巨噬细胞的招募以及相关炎症因子表达。A，正常鼻甲与鼻息肉组织中中性粒细胞募集的LY-6G免疫荧光检测代表性图像（A1）与统计学分析（A2）；标尺，100ym；n=10o B，正常鼻甲与鼻息肉组织中巨噬细胞募集的F4/80免疫荧光检测代表性图像（B1）与统计学分析（B2）；标尺，100gm；n=10o C，正常鼻甲与鼻息肉组织中TNF-a、IL-1p和IL-6mRNA表达水平的荧光定量RT-PCR检测结果与统计学分析；***,P<0.001；n=10

Fig.3The recruitment of neutrophils and macrophages and the expression of related inflammatory factors in normal turbinate and nasal polyp tissues.A, representative images(A1)and statistical analysis(A2)of neutrophil recruitment detected by LY-6G immunofluorescence in normal turbinate and nasal polyp tissues;B,representative images(B1)and statistical analysis(B2)of macrophage recruitment detected by F4/80immunofluorescence in normal turbinate and nasal polyp tissues;C,Quantitative results and statistical analysis of TNF-a,IL-1 p,and IL-6mRNA levels detected by real-time RT-PCR in normal turbinate and nasal polyp tissues;***,P<0.001;n=10

鼻息肉的临床症状，而不能“治愈”这种疾病［13-15］。

近年来，大量临床样本发现IgG4相关疾病与纤维炎性疾病之间具有密切联系，包括肝脏纤维化，肾纤维化，腹膜后纤维化，关节纤维化等［16,17］。这在些临床疾病组织中，发现IgG4均呈现特异性高

表达。在本实验研究中，鼻息肉组织中IgG4也呈现了高表达的特征，同时配合常规病理染，我们得知鼻息肉的纤维化很大程度上是他的一种特异性病变。

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