CHO 细胞Kcmfl 基因内定点整合ZsGreenl 杨蕾！，
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zing tv*
"收稿日期:2019-11-22
基金项目：国家863计划项目（2015AA020802）'
*通信作者：金 坚（I960—），男，博士，教授，博士研究生导师，主要从事药物设计与分子药理学研究° E-mail :********************
杜润生逝世（1.江南大学生物工程学院，江苏无锡214122； 2.江南大学药学院，江苏无锡214122）
摘要：以Kcmfl 基因NW&003614172.1第629890碱基处定（整合ZsGreenl 报告基因的CHO-南昌七城会
K1细胞（2C3）为研究材料，采用倒置荧光显微镜和流式细胞仪定量分析ZsGreenl 的表达，开展
系统的稳定性表达研究$ 2C3细胞贴壁培养连续传代50代次，100%的细胞可以稳定表达
ZsGreenl 报告基因。无血清悬浮驯化培养2C3细胞后，细胞表达ZsGreen1的平均荧光强度明显
降低；连续悬浮传代培养60代次，表达ZsGreen1的细胞数目显著增多，添加体积分数10% FBS 到悬浮培养的细胞池，ZsGreen1阳性细胞比例上升到95%以上$流式细胞术分选细胞池中高、
低表达ZsGreen1蛋白的2C3细胞,PCR 确认它们均含有ZsGreenl 报告基因；Q-PCR 发现在高、 低表
达ZsGreen1蛋白的细胞中，相关的ZsGreen1 mRNA 水平有明显的差异。提示CHO-K1细 胞Kcmfl 基因内非编码区域定（整合外源基因后，不会因细胞分裂和生长而丢失外源表达基 因；悬浮驯化需要优化培养基和培育条件，达到 细胞的需求。
关键词：定（整合；稳定性；ZsGreen1
中图分类号:Q 786；Q813 文章编号：1673-1689（2021 ）04-0058-09 DOI : 10.3969/j.issn. 1673-1689.2021.04.007
Expression Stability of ZsGreenl Reporter Gene in Kcmfl Gene of CHO Cells
YANG Lei 1, DING Xuefeng 1, CAI Yanfei 2, CHEN Yun 2, GONG Xiaohai 2,
DUAN Zuoying 1, LI Huazhong 1, JIN Jian *
2
(1. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. School of Pharmaceutical Sciences,
Jiangnan University, Wuxi 214122, China )
Abstract : The expression of ZsGreen1 in CH0-K1 cells (2C3) with the ZsGreenl reporter gene
integrated at the 629890 base of Kcmfl gene NW_003614172.1 was quantitatively analyzed by
inverted fluorescence microscope and flow cytometry to carry out the systematic stability expression
study. The ZsGreenl reporter gene could be expressed stably in 100% of 2C3 cells after continuous
passage of 50 generations in adherent culture. After cultured without serum, the average fluorescence
intensity of ZsGreen1 expression in 2C3 cells decreased significantly. After 60 generations of continuous suspension culture, the number of cells expressing ZsGreen1 increased significantly.
JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol. 40 Issue 4 2021
杨蕾，等：CHO细胞Kcmfl基因内定*整合ZsGreenl报告基因的表达稳定性研究
When10%FBS was added to the cell pool of suspension culture,the proportion of ZsGreenl positive cells increased to over95%.Flow cytometry sorted2C3cells with high and low expression of ZsGreenl protein in the cell pool,and PCR confirmed that they all contained the ZsGreenl reporter gene.Q-PCR found significant differences in the levels of related ZsGreenl mRNA in cells with high and low expression of ZsGreenl protein.It was suggested that the non-coding region of Kcmfl gene in CHO-K1cells integrated exogenous genes at specific sites,and the exogenous expressed genes would not be lost due to cell division and growth.The suspension and acclimation should optimize the culture medium and cultivation conditions to meet the needs of engineering cells construction.
Keywords:site-specific integration,stability,ZsGreenl
中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞作为生物技术药物生产细胞的优势地位已经明确，且构建适于稳定生产性生物制品的CHO 工程细胞系一直是研究工作的热点〔T&经典的CHO 工程细胞系构建均是采用目的基因随机整合%多轮单克隆筛选，挑选相对稳定表达目的蛋白细胞株的方法PT。带来的麻烦是构建工作费时费力，更重要的是无法知晓高、低表达目的蛋白的原因&随着主细胞库到生产细胞库的放大和生产过程，目的蛋的表达，目的蛋白表达的
生产性细胞克隆持续增加，难以达到生产和监管的要&构建定点整合的稳定表达基因的CHO 工程细胞系是的方法& CHO细胞的一、基因均已相
布，相品系的CHO细胞&对已的各种生产性生物制品的高、低达CHO 细胞株，合整合位点的构，地CHO细胞的稳定高表达整合位点用于建立生产CHO工程细胞系的报道[5-7]o 作以CHO-K1为细胞株，合应用
基因技术技术，以持续表达绿荧光标签的基因组内位点&测序结果明确了该整合位点为NW_003614172.1第629890碱基处，位于钾通道调节因子1(potassium channel modulatory factor1,Kcmfl)基因内部的一段非编码区域。该基因蛋白，的
08-94&以为基，构建单克隆以Kcmfl 基因NW_003614172.1第629890碱基处定点整合
ZsGreenl报告基因的CHO-K1细胞(2C3)，对其作为工程细胞的稳定性系&
1.1材料
1.1.1细胞株中国仓鼠卵巢细胞亚株CHO-K1，购自美国ATCC；2C3细胞，为染4 NW_00361417
数字示波器设计2.1内第629890号碱基处整合了
ZsGreenl基因的CHO-K1细胞株，由作者所在课题组构建存094&
1.1.2主要试剂Ha
*K sF-12K培养基、胎牛血清：美国Gibco公司产品；M2、M4无血清基础培养基：苏州康聚生物技术产品；PCR试剂：南京诺唯赞生物科技限产品；TRIzol试剂：仑生物公司产品；反转录试剂盒、SYBR®Green Master Mix：Takara公司产品；DEPC水、基因组DNA小量抽提试剂盒：上海碧云天生物技术限产品；他试剂均为国产分析纯。实验中所用引物列见1&
表1PCR引物列表
Table1List of PCR primers
当代艺术品投资ZsGreen1-F.15!-GCCCAGTCCAAGCACGG-3‘
664 ZsGreen1-R.15!-CGTGCTCGGTCAGGTGC-3‘
ZsGreen1-F.25'-GCCCTTCGCCGAGGACATCTTG-3!
202 ZsGreen1-R.25!-GTACATGCAGTTCTCCTCCACGC-3‘
很2021年第40卷第4期B B
YANG Lei,et al；Expression Stability of ZsGreenl Reporter Gene in Kcmfl Gene of CHO Cells
1.1.3仪器与设备细胞培养箱Series!Water Jacket!NANODROP2000：美国Thermo Fisher公司产品；倒置荧光显微镜、倒置式生物显微镜TE2000-S：日本NIKON公司产品；流式细胞仪、流式分选仪BD FACSAriaIII：美国BD公司产品；酶标仪infinite M200PRO、凝胶成像系统Tanon-5200Multi：上海天能公司产品；核酸电泳仪Mini-Protean、PCR仪C1000和Q-PCR仪CFX96：美国伯乐公司产品。
1.2方法中央电大形成性考核
1.2.1细胞培养CHO-K1细胞和2C3细胞在完全培养基（HamNs F-12K+体积分数10%FBS&内连续贴壁传代培养，培养条件为37!，体积分数5% CO2。
先后采用了两种方法对2C3细胞进行悬浮驯化：第一种是使用无血清基础培养基M2+M4%体积比为1：1）直接替完全培养基培养细胞，第种是使用无血清基础培养基M2+M4（体积比为1：1）逐代完全培养基，使培养基中血清体积分数也逐步递减，梯度为10%、8%、6%、4%、2%、1%、0.5%、0%，连续传代培养2~3次，当细胞生长状态良好为另一。
细胞驯化成功后，在150mL摇瓶中使用无血清基础培养基M2+M4（体积比为1：1）悬浮传代培养，培
养基为30mL，上培养条件为110r/min>37!、体积分数5%CO?。每天取样计数，调整细胞接种为1.0#106个/mL。
1.2.2MTT法检测2C3贴壁细胞的倍增时间将T75培养培养细胞用酶化后数，用完全培养基将细胞1#104个/mL，后2500个细胞接种到96,5
，种1096，置
培养箱中培养。第二天，取出一块96孔板，避光加入MTT，每孔10"L,4小时后加入MTT Buffer，每孔100"L，后用酶标仪测取560nm波长光。之后9天内，在每天相同一上，光
绘制出细胞的生长曲线。
1.2.3倒置荧光显微镜观察ZsGreen1蛋白表达情况贴壁细胞每分裂倍增10次，细胞汇合度达50%~60%时，倒置荧光显微镜ZsGreen1蛋白，选镜进行和荧光摄。每次拍摄条件一致,AE Compensation为+0.0EV, Exposure Time为1s,Gain为4#,Contrast为Linear，荧光场照片采用ImageJ软件分析细胞的平均荧光。
血清方法悬浮驯化细胞（2C3-M2M4+体积分数0%FBS），每次降低血清含ZsGreen1；直接使用无血清基础培养基培养的细胞（2C3-M2M4），细胞转培养时初次。驯化成功后悬浮2C3细胞，每分裂倍
增10次进行观察，拍摄条件及分析方法与贴壁细胞相同。
1.2.4流式细胞分析仪检测细胞平均荧光强度贴壁细胞每分裂倍增10次后取出部分细胞进行冻存，储存于液氮罐。在细胞总次数50次，苏前冻存的所有不同代次的细胞，传代培养细胞生长状态良好，使用流式细胞分仪检测细胞的平均荧光强度，检测结果使用FlowJo 7.6.2件进行分。
悬浮细胞在驯化成功后每分裂倍增10次进行流式分，检和贴壁细胞使用一条件，数
分析方法。
1.2.5流式细胞分选仪分选悬浮细胞池分析悬浮驯化成功的2C3细胞池，发现细胞池中的细胞表ZsGreen1荧光有一定差异。以未插入外源基因的CHO-K1细胞为阴性对照，收集10000个细胞定对照组细胞荧光，确定103为阴、阳性细胞分界：单细胞FITC-A荧光103为阴性细胞，高103时为阳性细胞。流式细胞分选仪对2C3细胞池进行分选，收集阴性细胞1.2#106个，分成四组分别培养在M2M4、M2M4+10%FBS、Ham's F-12K、Ham's F-12K+10%FBS四种培养基中％M2：M4体积比为1：1）；收集荧光高的10%阳性细胞3x105，使用无血清基础培养基扩培。
1.2.62C3细胞中ZsGreenl基因的分析使用基因组DNA小量抽提试剂盒，分别提取在无血清基础培养基里扩培后的阴性、阳性细胞基因组，使用表1中ZsGreen1-F.1和ZsGreen1-R.1引物进行PCR扩增，反
应体系为：2x Phanta®Max Buffer 12.5"L,dNTP Mix0.5"L,ZsGreen1-F.1（10"mol/L）1"L,ZsGreen1-R.1（10"mol/L）1"L,Phanta®Max Super-Fidelity DNA Polymerase0.5"L,DNA100ng, ddH2O补足25"L o扩条件为：95!预变性3min；
JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.40Issue42021
杨蕾，等：CHO细胞Kcmfl基因内定点整合ZsGreenl报告基因的表达稳定性研究
95!变性15s,58!退火15s,72!延伸45s, 30个循环；72!延伸5min,4!保存#PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并测序#
1.2.72C3细胞中Zs Greenl基因转录水平分析分别提取在M2M4、M2M4+10%FBS、Ham's F-12K、Ham's F-12K+10%FBS四种不同培养基中扩培的阴性细胞的RNA，将其反转录成cDNA，反转录体系为：5x PrimeScript RTMaster Mix(Perfect Real Time)4p X,Total RNA1!g,RNase Free dH2O补足20p L。轻柔混匀后使用PCR仪进行反转录反应，反应条件为：37!,15min；85!,5s；降温至4!，于-20!长期保存#反转录得到的cDNA产物进行Q-PCR，反应体系为：SYBR®Premix Ex TaqTM" (2x)10p L,ZsGreenl-F.2(10p mol/L)1p L, ZsGreen1-R.2(10p mol/L)1p L,cDNA10ng, ddH2O补足20p L0反应条件为：95!预变性30s；95!变性5s,60!延伸30s,40个循环；溶解曲线为65!反应5s,95!反应60s0
2.12C3细胞倍增时间检测结果
用MTT法检测560nm波长下的吸光值，绘制出的细胞生长曲线见图1。CHO细胞一般20-24h 分裂一次，定点整合ZsGreenl报告基因的CHO-K1细胞(2C3)的倍增时间与CHO-K1细胞大体一致，分裂24h，即每1天细胞发生1次
图12C3细胞生长速率
Fig.1Growth rate of2C3cells
2.2贴壁培养的2C3细胞表达ZsGreen!蛋白情况
为了验证位点NW_003614172.1表达外源基因的性,2C3细胞传代培养中ZsGreen1的表达情况。期细胞已进行了20代传代验，发现荧光蛋白
表达［10\。基于生产细胞库扩到生产
45-50代次的，验传至20代的2C3细胞为细胞，传代50次为实验，观察目的基的，进行性。体实验为，每传10个代次，用光并1记录，见图2(a)，光使用ImageJ件分析细胞的光，见图2(b)。同，传代中每传代10次进行一次细胞存，在传代50次后，存的不同代次的细胞，使用细胞仪进一光的进行分，见图2(c)、(d)。光的
细胞仪分，在传代培养50代的中,100%的2C3细胞可I
ZsGreenl基。
2.3悬浮培养的2C3细胞表达ZsGreenl蛋白情况
性生物制的生产基用
细胞生产，在验培养的2C3细胞ZsGreen1的性后，对其进行了悬。先采用基培养基完全培养基的方法2C3细胞。当细胞生长良好，
小一，数能隔天翻，认为其成功，开
进行基础培养基传代培养。光显发现，细胞ZsGreen1光较培养基中含有明显差异，细胞光：降低。为了判断此现象是否更培养基引起的细胞不适应导致，用了第二种方法，使培养基中浓逐步递减，但是成功后到了同样的验：细胞光：较培养基中含有明差异。
两种方法成功的细胞传代培养30、60d后，光到细胞光有所提高，见图3，同使用细胞仪
不同代次的细胞光的进行检测，使用FlowJo7.6.2件分析检测结果，见图4。以CHO-K1细胞为，通传代培养后，达荧光蛋白的细胞数多，阳性细胞比例有了12%-15%的提升。
同，发当培养使用的
基础培养基中加入体积分数10%后，悬浮细胞池中光的细胞比例明显提升,95%上的细胞能够ZsGreenl基因，见图5。
令报2021年第40'第4
期
YANG Lei ,et al ： Expression Stability of ZsGreenl Reporter Gene in Kcmfl
Gene of CHO Cells
10 d 20 d 30d 40d 50 d
(a)倒置荧光显微镜观察结果
5 0 5 0 5
2 2 11d
d d M d ” m ao g lo csi
三三(d)流式细胞仪定量分析结果
(b)Image 墩件分析细胞
平均荧光强度
(c)流式细胞仪定量分析ZsGreenl
蛋白质表达水平
图2贴壁传代培养的2C3细胞表达ZsGreenl 蛋白情况
Fig. 2 Expression of ZsGreenl protein by adherently subcultured 2C3 cells
0% FBS 0%FBS 30 d 0%FBS 60 d
(a)直接撤血清法驯化细胞时蛋白的表达情况
6%FBS 4% FBS 2% FBS 0%FBS 0% FBS 30 d 0% FBS 60 d
(b)递减血清法驯化细胞时蛋白的表达情况
图3 悬浮传代培养的2C3细胞表达ZsGreenl 蛋白情况
Fig ・ 3 Expression of ZsGreenl protein in suspension-cultured 2C3 cells
2.4 ZsGreenl 蛋白的DNA 水平验证
为了确认流式分析仪检测到的阴性细胞是否 在细胞分裂过程中丢失了 ZsGreenl 基因，采用流式 细胞术从直接更换培养基的方法中驯化成功的2C3
细胞分选细胞，以未插入外源基因的CHO-K1为对
照，以FITC-A 荧光强度值103为阴性和阳性细胞 的分界，分别收集细胞，见图6。
以分别回收的1.50X 106个荧光蛋白表达阴性 和阳性细胞为材料，分别提取基因组，PCR 扩增
ZsGreenl 基因，琼脂糖凝胶电泳验证扩增结果见图7 ,
JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol. 40 Issue 4
2021
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