抑制作用及其机制
刘旭，杨胜荣，王希敏
逸仙论坛天津市南开医院，天津300010
摘要：目的观察雷公藤红素对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的影响，并探讨其作用机制。方法用脂肪细胞诱导培养基培养3T3-L1细胞，分别给予0、0.2、0.3、0.4、0.5µmol/L的雷公藤红素处理48h，CCK8检测细胞增殖能力。以0、0.3µmol/L的雷公藤红素作用于3T3-L1细胞，采用油红O染法观察3T3-L1细胞成脂分化情况、细胞中脂质累积情况。分别采用RT-PCR法和Western blotting法检测3T3-L1细胞中的CCAAT/增强子结合蛋白α（C/
EBPα）、过氧化物酶体增殖物激活受体g2（PPARg2）、脂肪酸蛋白4（FABP4）的mRNA和蛋白。利用在线药物靶点预测软件Swiss Target Predication分析雷公藤红素的潜在作用靶点并验证。结果0.3µmol/L以上剂量的雷公藤红素作用后细胞增殖能力明显减弱。0.3µmol/L雷公藤红素作用后，3T3-L1细胞中脂质累积明显减少，C/EBPα、PPARg2、FABP4mRNA及蛋白相对表达量均降低（P均<0.05）。PTPN11可能是雷公藤红素的潜在作用靶点，雷公藤红素可在mRNA和蛋白水平下调PTPN11表达（P均<
0.05）。结论雷公藤红素可抑制前脂肪细胞3T3-L1成脂分化，其机制与下调PTPN11表达、抑制脂肪生成相关蛋白信号通路有关。
关键词：雷公藤红素；前脂肪细胞；成脂分化；PTPN11
doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2021.08.007
中图分类号：R965文献标志码：A文章编号：1002-266X（2021）08-0028-04
Inhibition of celastrol on adipogenic differentiation of3T3-L1preadipocytes
LIU Xu，YANG Shengrong，WANG Ximin
Nankai Hospital，Tianjin300010，China
Abstract：Objective To investigate the effect of celastrol on the adipogenic differentiation in3T3-L1preadipocytes and to explore its potential mechanism.Methods The3T3-L1preadipocytes were cultured and treated with celastrol （0，0.2，0.3，0.4，and0.5µmol/L）for48h.The cell proliferation was measured by CCK-8assay.3T3-L1preadipo⁃cytes were treated with0and0.3µmol/L celastrol.The adipogenic differentiation and lipid accumulation of3T3-L1adipo⁃cytes were observed by oil red O sta
ining.The gene expression levels of CCAAT/enhancer binding proteinα（C/EBPα），peroxisome proliferator-activated receptor（PPARg2），and fatty acid binding protein-4（FABP4）mRNA and protein were determined by RT-PCR and Western blotting，respectively.The potential targets of celastrol were analyzed and identified by Swiss Target Predication software.Results The cell proliferation ability decreased significantly after celastrol treat⁃ment at a dose of more than0.3µmol/L.After0.3µmol/L celastrol treatment，lipid accumulation in3T3-L1cells was significantly reduced，and the relative expression levels of C/EBPa，PPARg2，FABP4mRNA and protein all decreased （all P<0.05）.PTPN11might be a potential target of celastrol.Celastrol could down-regulate the expression of PTPN11 both at mRNA and protein levels.Conclusion Celastrol significantly inhibits cell proliferation and differentiation of3T3-L1preadipocytes through the down-regulating of PTPN11expression and inhibiting adipogenesis-related protein signaling pathways.
Key words：celastrol；preadipocytes；adipogenic differentiation；PTPN11
2型糖尿病（T2DM）发病率呈逐年升高趋势，我国目前有超过1亿的成年糖尿病患者［1］。90%以上的T2DM患者均存在胰岛素抵抗（IR），同时伴或不伴有胰岛素相对分泌不足。发生IR的T2DM患者体内正常胰岛素浓度的生物学效应低于正常，究其原因是胰岛素靶组织对胰岛素的敏感性和反应性降
第一作者简介：刘旭（1984-），女，主治医师，主要研究方向为内分泌代谢及消化系统疾病。E-mail：boboxu_lx@126.
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开放科学（资源服务）标识码（OSID）
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低。临床糖尿病大多立足于改善胰岛素敏感性。肥胖是IR发生的最主要因素［2］。CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）、过氧化物酶体增殖物激活受体g2（PPARg2）和脂肪酸蛋白4（FABP4）是脂肪生成相关蛋白，这些蛋白表达增加可以明显增强脂肪细胞的成脂分化。在脂肪细胞中，胰岛素通过磷酸化胰岛素受体来激活胰岛素受体底物（IRS），磷酸化的IRS结合磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的调节亚基
p85，进而激活催化亚基p110来活化丝/苏氨酸蛋白激酶（AKT）信号通路，刺激葡萄糖转运蛋白4从细胞质转位至细胞膜，促进各个组织的葡萄糖摄取及利用［3-4］。雷公藤红素来源于中药雷公藤根皮，是一种具有多种天然活性的醌甲基三萜，是雷公藤片和雷公藤多苷片等制剂的有效成分之一。雷公藤红素已用于多种疾病的，其药理作用除了抗炎、抗肿瘤外，还有抗糖尿病和肥胖的作用［5-11］。在高脂饮食诱导的肥胖鼠模型中，雷公藤红素能够减少鼠进食量，增加能量消耗，发挥强效减轻体质量效果。但雷公藤红素与脂肪分化之间的关系尚未见报道。2018年10月—2019年11月，本研究以前脂肪细胞3T3-L1为模型，观察了雷公藤红素对成脂分化的影响，并探讨其可能的作用机制。
1材料与方法
1.1细胞与主要实验材料前脂肪细胞3T3-L1接种于含10%FBS、200U/mL青霉素、200U/mL链霉素的DMEM培养基中，放于37℃、5%CO2加湿培养箱中培养。雷公藤红素购自上海诗丹德生物公司，纯度>98%。FBS和DMEM培养基购自美国HyClone 公司。CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术研究所。TRIzol购自美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒、PCR试剂盒购于北京全式金生物公司。PCR引物购自北京擎科新业生物技术有限公司。C/EBPα抗体、FABP4抗体、PPARg2抗体、PTPN11抗体均购于美国Proteintech公司。HRP标记的羊抗兔二抗购自三箭生物技术公司。
1.23T3-L1细胞成脂分化诱导及雷公藤红素作用浓度筛选
1.2.1成脂分化诱导在37℃、5%CO2的湿润环境中，3T3-L1细胞在脂肪细胞诱导培养基（含10% FBS、0.5µmol/L地塞米松、0.25mmol/L甲基异丁基黄嘌呤、5µg/mL胰岛素和50µmol/L吲哚美辛的α-MEM培养基）中培养3d达到约90%融合。1.2.2雷公藤红素作用浓度筛选雷公藤红素用DMSO配置成50mmol/L备用。将3T3-L1细胞以3×103/孔接种到96孔板中，在脂肪细胞诱导培养基中
培养，分别给予0、0.2、0.3、0.4、0.5µmol/L的雷公藤红素于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养48h。将CCK-8试剂添加到每个孔中，37℃下培养2h。用多功能酶标仪于450nm波长处检测吸光度值。小剂量雷公藤红素对细胞增殖能力无明显影响，0.3
µmol/L以上剂量的雷公藤红素作用后细胞增殖能力明显减弱。选择0.3µmol/L剂量用于后续实验。
1.3雷公藤红素作用后3T3-L1细胞中脂质检测3T3-L1细胞在脂肪细胞诱导培养基中培养达到90%融合后，分别给予0、0.3µmol/L的雷公藤红素处理3d。用冷PBS将处理过的细胞轻轻清洗2次，在室温下于4%多聚甲醛中固定10min。随后，细胞用去离子水洗涤2次，并在室温下用60%饱和油红O染5min。每孔加入4%异丙醇，在振动摇床上摇动15min，520nm波长下测定提取染料光吸收率反映细胞内油红O含量。
1.4雷公藤红素作用的3T3-L1细胞中脂肪生成相关基因检测3T3-L1细胞培养及处理方法同“1.3”。用TRIzol试剂提取细胞总RNA，然后用逆转录试剂盒将每个样本的RNA1µg逆转录成cD⁃NA，逆转录条
件为25℃10min，37℃1h，85℃2 min。应用SGExcel Fast SYBR Mixture kits进行qP⁃CR检测。95℃预变性2min，95℃10s、60℃10s、72℃10s，共40个循环。以β-tubulin为内参。C/ EBPα上游引物序列为5′-CTGATTCTTGCCAAACT⁃GAG-3′，下游引物序列为5′-GAGGAAGCTA⁃AGACCCACTAC-3′；PPARγ上游引物序列为5′-CTT⁃GACAGGAAAGACAACGG-3′，下游引物序列为5′-GCTTCTACGGATCGAAACTG-3′；FABP4上游引物序列为5′-AAATCACCGCAGACGACAGG-3′，下游引物序列为5′-GGCTCATGCCCTTTCATAAAC-3′。以2－ΔΔCt表示目的基因相对表达量。
1.5雷公藤红素作用的3T3-L1细胞中脂肪生成相关蛋白检测3T3-L1细胞培养及处理方法同“1.3”。处理后的细胞用RIPA裂解液裂解，应用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度。每组取20µg蛋白样本行12%SDS-PAGE电泳，PVDF转膜；5%脱脂牛奶室温封闭1h，分别加入一抗tubulin抗体（1∶2000）、C/EBPα抗体（1∶1000）、FABP4抗体（1∶1000）、PPARγ抗体（1∶1000）于4℃孵育过夜；PBST洗膜后，加入二抗（1∶5000）室温孵育1h，PBST洗膜后用ECL化学发光法染；Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。
1.6雷公藤红素作用靶点预测及验证利用在线
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职业病范围和职业病患者处理办法的规定
药物靶点预测软件Swiss Target Predication分析雷公藤红素的潜在作用靶点。3T3-L1细胞培养及处理方法同“1.3”。分别采用RT-PCR法和Western blot⁃ting法检测预测靶点基因和蛋白表达。
1.7统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料以-x±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey或Dunnett检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1雷公藤红素作用的3T3-L1细胞中脂质积累情况0、0.3µmol/L的雷公藤红素处理3d后，3T3-L1细胞中脂质累积分别为97.33%±1.45%、3
3.33%±3.48%，雷公藤红素处理后细胞中脂质累积减少（P均<0.01）。见图1。
2.2雷公藤红素对3T3-L1细胞脂肪生成相关基因及蛋白表达的影响0.3µmol/L雷公藤红素作用后，3T3-L1细胞中C/EBPα、PPARg2、FABP4mRNA 及蛋白相对表达量均降低（P均<0.05）。见表1。
2.3雷公藤红素药物作用靶点预测及验证情况雷公藤红素药物作用靶点主要与酶（20.0%）、核受体（20.0%）、磷酸酶（1
3.3%）、TLR-1和IL-1受体（6.7%）、细胞素P450（6.7%）等相关。在预测出的30多种雷公藤红
素可能药物靶点中，PTPN11排名位于前列，提示PTPN11很可能是雷公藤红素的作用靶点。实验结果显示，0、0.3µmol/L雷公藤红素处理的3T3-L1细胞中PTPN11mRNA相对表达量分别为1.079±0.079、0.375±0.029，PTPN11蛋白相对表达量分别为1.128±0.064、0.669±0.084。雷公藤红素作用于3T3-L1细胞后，PTPN11mRNA 及蛋白表达均下调（P均<0.05）。
3讨论
雷公藤红素作为一种传统中药，也已被用于糖尿病和肥胖的［15］。文献报道，雷公藤红素可通过抑制NF-κB信号通路激活来减少前脂肪细胞3T3-L1中活性氧生成，提高线粒体膜电位［16-17］。雷公藤红素可通过激活PI3K/Akt通路来增加胰岛素信号通路活性［18］。雷公藤红素还有助于增加高脂膳食诱导的肥胖小鼠对瘦素的敏感性。还有研究认为，雷公藤红素能够减少摄食量、增加能量消耗，从而发挥强效减重作用［15］。胰岛β细胞功能障碍是T2DM决定性的发病因素。雷公藤红素可以直接作用于胰岛β细胞，抑制胰岛β细胞凋亡［19］。但是，雷公藤红素对成脂分化的调控作用尚未见研究报道。本研究观察了雷公藤红素对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的影响，并探讨相关机制，进一步探索雷公藤红素在糖尿病中的潜在价值。
脂肪细胞的特征表现之一是脂滴形成。细胞内脂滴大小和数量是评价细胞成脂分化程度的量化指标。本研究油红O染结果显示，经不同浓度雷公藤红素作用的3T3-L1细胞胞质着比较深，脂滴体积较
大，脂滴数目较多，表明各组细胞都出现了成脂分化现象，但雷公藤红素作用组成脂分化能力受到抑制，且抑制程度与雷公藤红素作用浓度相关。这表明，雷公藤红素能够抑制前脂肪细胞的成脂分化。
PPARg2和C/EBPα是脂肪细胞分化的两种关键转录因子。其中PPARg属于核受体超家族成员，是在成脂分化过程中起核心调控作用的特异性转录因子，通过调控C/EBPalpha、FABP4表达来调节脂肪细胞分化速度和脂滴形成［12］。FABP4是成熟脂肪细胞胞质蛋白，是反映成脂分化能力的关键指标之一［13-14］。本研究结果显示，0.3µmol/L雷公藤红素作用后，3T3-L1细胞中C/EBPα、PPARg2、FABP4 mRNA及蛋白相对表达量均降低，进一步表明未经雷公藤红素处理的细胞成脂分化能力最高，而雷公藤红素作用降低了前脂肪细胞的成脂分化能力。
本研究利用在线药物靶点预测软件Swiss Tar⁃get Predication分析雷公藤红素的潜在作用靶点，结果显示，雷公藤红素药物作用靶点主要与酶、核受体、磷酸酶、TLR-1和IL-1受体、细胞素P450等相关，PTPN11可能是雷公藤红素的潜在作用靶点，
且图1不同浓度雷公藤红素作用的3T3-L1细胞中脂质积累情况
表1不同浓度雷公藤红素作用后3T3-L1细胞脂肪生成相关基因及蛋白表达比较（-x±s）
浓度
0µmol/L 0.3µmol/L
C/EBPα
mRNA
1.229±0.229
0.175±0.071*
蛋白醋酸铝
1.145±0.022
0.239±0.071*
PPARg2
mRNA
1.151±0.115
0.299±0.035*
蛋白
1.054±0.026
0.591±0.030*
FABP4
mRNA
0.887±0.113
0.151±0.063*
蛋白
1.107±0.056
0.432±0.028*
注：与0µmol/L组相比，*P<0.05。30
雷公藤红素可在mRNA和蛋白水平降低PTPN11的表达。研究表明，脂肪组织通过分泌包括瘦素在内的多种脂肪因子来调节细胞能量代谢及生理活动［20］。瘦素是目前研究较为广泛的脂肪因子，其可诱导STAT3磷酸化并转位至细胞核中，使瘦素靶基因转录，完成瘦素的信号转导。PTPN11基因编码蛋白酪氨酸磷酸酶2（SHP-2），后者参与胞外刺激信号传入胞内的过程，调控Ras/Raf/MAPK、JAK/STAT、
ERK及PI3K等多种信号转导通路的活化。除了SHP-2广为人知的对肿瘤的调节作用外，SHP-2亦调控肥胖发生。SHP-2可调节瘦素的表达水平，SHP-2基因敲除小鼠的后代即使正常饮食也会比野生型小鼠易于出现早期肥胖。结合文献报道及本研究中雷公藤红素抑制3T3-L1细胞成脂分化的结果，推测PTPN11基因编码的SHP-2很有可能是雷公藤红素抗成脂分化作用的靶点。
综上所述，雷公藤红素可抑制前脂肪细胞3T3-L1成脂分化，其机制与下调PTPN11表达、抑制脂肪生
成相关蛋白信号通路有关，上述研究结果仍需后续实验进一步证实。
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（收稿日期：2020-04-02）
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