学术论著
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*基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金(2017D01C006)“阻断PI3K/mTOR通路逆转白血病干细胞免疫抵抗的机制研究” ①喀什地区第一人民医院检验科 新疆 喀什 844000②广东省第二人民医院检验科 广东 广州 510317作者简介：何川疆，男，(1987- )，硕士研究生，主管技师，从事临床检验工作。 [文章编号] 1672-8270(2021)05-0183-05 [中图分类号] R733.71 [文献标识码] A
The expression of NKG2D ligand of KG1a cell with the participation and regulation of P13K/mTOR signaling pathway/HE Chuan-jiang, ZHANG Su-jie, LIU Wen, et al//China Medical Equipment,2021,18(5):183-187.
[Abstract] Objective: The low expression of the ligand of natural killer cell group 2D (NKG2D) is a key factor that leukemia stem cells (LSC) escapes cytokine induced killer, and PI3K/mTOR signaling pathway is highly activated in LSC. The aim of this study is to investigate whether the PI3K/mTOR signaling pathway is involved in the expression of NKG2D ligand in regulating LSC. Methods: After the PI3K/mTOR signaling pathway inhibitor NVP-BEZ235 was adopted to intervene human acute myelocytic leukemia cell (KGla cell), the cell technique kit (CCK-8) was adopted to detect the proliferation of KGla cell, and flow cytometry (FCM) was adopted to detect the KGla cell cycle and apoptosis, and real-time fluorescence quantification polymerase chain reaction (RT-qPCR) and Western blot (WT) were adopted to detect the expressions of MICB, ULBP1, ULBP2 and ULBP3 of NKG2D ligand in cell. Results: The NVP-BEZ235 inhibitor significantly inhibited the proliferation of KG1a cells, and inhibited the KGla cell cycle at G0/G1 stage. After NVP-BEZ235 inhibitor intervened cell, the relative expression amount of MICB mRNA of NKG2D ligand in KGla cell was significantly increased, and the expression amount of ULBP1, ULBP2, ULBP3, mRNA and protein also were sign
ificantly increased. Conclusion: PI3K/mTOR can regulate the LSC proliferation and cycle, and it can regulate the NKG2D expression. This result provides data support for inhibiting drug resistance LSC with targeted therapy by PI3K/mTOR.
[Key words] PI3K/mTOR signaling pathway; Leukemia stem cell; Cell cycle; Natural killer cell group 2D (NKG2D) ligand [First-author’s address] Department of Laboratory , The First People's Hospital of Kashgar District,Kashgar 844000, China.
[摘要] 目的：自然杀伤细胞活化性受体(NKG2D)配体的低表达是白血病干细胞(LSC)逃避免疫杀伤的关键因素，磷脂酰肌醇3-激酶/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/mTOR)信号通路在LSC中高度活化，探讨PI3K/mTOR信号通路是否参与调控LSC中NKG2D配体的表达。方法：采用PI3K/mTOR信号通路抑制剂NVP-BEZ235对人急性骨髓白血病细胞(KG1a细胞)进行干预后，采用细胞技术试剂盒CCK-8检测KG1a细胞增殖，采用流式细胞术检测KG1a细胞周期及凋亡，采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)及免疫印迹(Western blot)检测细胞中NKG2D配体MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3的表达。结果：抑制剂NVP-BEZ235显著抑制KG1a细胞的增殖，并将KG1a细胞周期阻滞于细胞周期G0/G1期；NVP-BEZ235抑制剂干预后，KG1a细胞NKG2D配体MICB信使核糖核酸(mRNA)相对表达量显著升高，ULBP1、ULBP2、ULBP3、 mRNA及蛋白表达量也显著升高。结论：PI3K/mTOR调控LSC的增殖及周期，且其能够调控NKG2D的表达，该结果为通过PI3K/mTOR 抑制靶向耐药的LSC提供 了数据支持。
[关键词] PI3K/mTOR信号通路；白血病干细胞；细胞周期；自然杀伤细胞活化性受体(NKG2D)配体DOI: 10.3969/J.ISSN.1672-8270.2021.05.045
何川疆① 张素杰① 刘 雯① 李泽泳② 周慧芳① 胡亮杉② 张丽萍① 许爱敏①*
P13K/mTOR信号通路参与调控
KG1a细胞NKG2D配体的表达
*
中国医学装备2021年5月第18卷第5期 China Medical Equipment 2021 May V ol.18 No.5
白血病发病率呈逐年上升趋势，是导致青少年死亡的首位疾病[1]。虽然造血干细胞移植后重建的免疫系统能清除体内的白血病细胞，使长期生存率得以明显改善，但仍有超过70%的患者会复发[2]。大量研究表明白血病干细胞(leukemia stem cells，L S C )是导致白血病复发的罪魁祸首。L S C 低表达或不表达免疫激活物自然杀伤细胞活化性受体(natural killer cell group 2D，NKG2D)配体[3-4]。NKG2D是活化免疫细胞表面的主要活化性受体，能够识别肿瘤细胞表面表达的非经典主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)样分子(MHC class I chain related A and B，MICA/B)
和UL16结合蛋白1-3(UL16-binding protein 1-3，ULBP1-3)家族成员，统称为NKG2D配体，也称之为免疫激活物[5]。NKG2D配体与免疫细胞表面的NKG2D结合，激活免疫细胞，使其分泌穿孔素和颗粒酶直接使靶细胞溶解破坏，这是活化免疫细胞清除肿瘤细胞的重要途径之一[6]。因而，缺少NKG2D配体的LSC可以逃脱免疫细胞的杀伤，是LSC不能被免疫系统有效清除的主要原因之一。本研究以人急性骨髓白血病细胞(KG1a细胞)表面标志物CD34+CD38-CD123+为靶细胞，磷脂酰肌醇3-激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/mammalian target of rapamycin，PI3K/mTOR)信电源技术
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KG 1a 细胞NKG 2D 配体的表达*-何川疆 等
号抑制剂作为干预因素，观察阻断PI3K/mTOR信号通路后LSC免疫激活物NKG2D配体表达的变化，探讨阻断PI3K/mTOR信号对逆转LSC免疫抵抗的作用机制，为降低白血病复发提供新靶点和新策略。1 材料与方法1.1 仪器设备与试剂
中美外交档案解密
(1)主要仪器设备。Axio Observer A1型荧光倒置显微镜(德国Zeiss公司)；Research ®plus型移液器(德国Eppendorf公司)；HF240型二氧化碳(CO 2)培养箱(上海力康生物医疗科技控股有限公司)；BSC-1500II A2型生物安全柜；LC-4016型低速大容量离心机(合肥 安徽中科中佳科学仪器有限公司)；Multiskan GO型全光栅酶标仪(美国Thermo Fisher 公司)；A G S 4800型实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪(杭州安杰思医学科技股份有限公司)；BriCyte E6型流式细胞仪(深圳迈瑞公司)
(2)主要试剂。RPMI-1640培养基(美国GIBCO 公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、1%青-链霉素(HyClone，美国GE Healthcare Life Sciences)；NVP-BEZ235抑制剂(美国Apexbio公司)；细胞计数试剂盒-8(cell counting Kit-8，CCK-8)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)anti-human CD38、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)anti-human CD34和FITC anti-human CD123(美国Biolegend公司)；总RNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]；细胞周期检测试剂盒、凋亡检测试剂盒(Solarbio北京索莱宝科技有限公司)。
1.2 细胞来源与细胞培养
(1)细胞来源。人急性骨髓白血病细胞系KG1a购自上海名劲生物(CM-1778)，经短片段重复(short tandem repeat，STR)序列检测验证为KG1a细胞，支原体检测阴性。
信息披露(2)细胞培养。用含10%FBS、1%青-链霉素(100 U/ml)的RPMI-1640完全培养基将细胞稀释为1×106个/ml密度，接种于T25细胞培养瓶中，置于5％CO 2、37 ℃、饱和湿度培养箱中培养，之后每3 d按1:3比例传代1次。倒置显微镜观察细胞形态及生长状态。
(3)实验分组。PI3K/mTOR信号通路抑制剂NVP-BEZ235干预KG1a细胞，根据设置干预浓度不同，将0.00 μmol/L分为空白对照，0.125 μmol/L、
0.25 μmol/L、0.5 μmol/L和1.0 μmol/L。1.3 CCK-8法检测细胞增殖
将细胞以1×105个/ml接种到96孔板中(100 μL/孔)，置于5％CO 2培养箱于37 ℃中预培养24 h。不同条件干预细胞后监测细胞存活率，每孔添加10 μl细胞技术试剂(cell counting Kit-8，CCK-8)溶液，37 ℃孵育4 h，在Multiskan GO酶标仪上450 nm处测量吸光度值。每组设定6个复孔，计算细胞活力。1.4 流式细胞检测
收集不同条件干预后的KG1a细胞，以1800 r/min 离心6 min，计数并将细胞密度重悬为1×107个/ml，取100 μl细胞悬液于流式检测管中。①表面标志物检测：添加5 μl CD34抗体，5 μl CD123抗体，5 μl
CD38抗体；②细胞周期检测：使用细胞周期检测试剂盒，加100 μl核糖核酸酶A(ribonuclease A，RNase A)溶液，37 ℃水浴30 min，再加入400 μl碘化丙啶(propidium iodide，PI)染液混匀，置于4 ℃避光孵育30 min；③细胞凋亡检测：使用凋亡检测试剂盒，参考说明书进行ANNEXIN V-FITC及PI的标记。吹打混匀后避光4 ℃孵育20 min，使用2 ml磷
酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)洗去未结合的抗体，将细胞重悬于500 μl的PBS中，放入流式细胞仪进行检测，每个样本中目标细胞记录20,000个粒子。使用FlowJo TM (V7.6，BD)分析流式检测数据。
1.5 RT-qPCR 检测
收集各组细胞，提取总RNA，检测总RNA浓度及纯度。从核苷酸序列GenBank数据库获得NKG2D 配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2及ULBP3的信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)，并设计引物。将提取的RNA反转录为cDNA。进行RT-qPCR检测，反应条件为95 ℃，10 s，40次循环
10 s；60 ℃，34 s。使用2-ΔΔCt方法计算mRNA相对表达量。所用基因引物见表1。1.6 免疫印迹(Western blot)检测
从细胞中提取总蛋白，并进行蛋白定量。蛋白样本加至10%聚丙烯凝胶(sodium dodecyl sulfate polya
crylamide gel electropheresis，SDS-PAGE)上(40 μg per lane)，并于200 mA恒定电流、60 min转移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，VDF) membrane(0.45 μm，Millipore)。在室温下，将膜取出放置于含5％BSA的TBS中封闭1 h后，取出膜放
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KG 1a 细胞NKG 2D 配体的表达*-何川疆 等
表1 基因引物信息
基因引物序列
MICA Forward 5’-AGCGGGAATCACAGCACTCACC-3’Reverse 5’-TAGCAGCAGCCAGCAGCAACAG-3’MICB Forward 5’-GCTGGTGCTTCAGAGTCAACG -3’Reverse 5’-GCATCCCTGTGGTCTCCTGTC-3’ULBP1Forward 5’-GCTGGCAGATGAGGAGAGTTG-3’Reverse 5’-AAAGGCACAGTGGTGAGTAGACA-3’ULBP2Forward 5’-AATGGGAGACTGTATAGGATGG-3’Reverse 5’-ATGATGAGGAGGCAGCAAAGG-3’ULBP3Forward 5’-TGGCTTAGGGACTTCCTGATGC-3’Reverse 5’-GGTGGCTATGGCTTTGGGTTG-3’GAPDH
Forward 5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’Reverse 5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’
入MICA、MICB、ULBP1、ULBP2及ULBP3抗体稀释液中(1∶500)，于4 ℃孵育过夜；取出孵育后的膜放入三羟甲基氨基甲烷盐吐温(tris buffered saline tween，TBST)缓冲液中，室温下置于摇床洗涤3次，每次15 min。将转移膜至二抗稀释液中，室温孵育1 h。室温下置于摇床TBST洗涤3次，每次15 min，ECL显法检测蛋白表达。使用ImageJ软件(V1.52 s)对蛋白条带进行成像和分析。1.7 统计学方法
采用SPSS19.0软件对所有数据均进行分析，计
量资料以均值±标准差(x
-±s )表示，两组之间进行单尾t 检验。以P ＜0.05为差异有统计学意义。2 结果
2.1 细胞培养及鉴定
KG1a细胞形态为多边形淋巴细胞样悬浮细胞，聚集为小团块生长，细胞传代后48 h可达80%～90%，生长速度快。流式细胞术鉴定细胞表面CD34+
、CD123+
及CD38-的表达，结果显示，CD34+
表达量为99.76%，CD123+
阳性表达量为97.64%，CD38-阳性表达量为5.37%。KG1a细胞形态观察及流式细胞术表型鉴定见图1。
对KG1a细胞进行生长曲线测定，结果显示，细
胞培养后0～24 h为潜伏期，24 h后进入指数生长期，至培养72 h后进入平台期，见图2。
注：①图中A 为传代后培养48 h 的KG1a 细胞(×100)，B 为传代后培养48 h 的KG1a 细胞(×400)，C
为流式鉴定CD34＋，D 为
流式鉴定CD123＋，E 为流式鉴定CD38－；②图C 、D 、E 中红线条代表同型对照(即阴性)，绿线条分别为样本CD34＋、CD123＋和CD38－的表达
图1 KG1a 细胞形态观察及流式细胞术表型鉴定结果
D A E
B
C CD34＋CD123＋CD38-
图2 KG1a
细胞生长曲线
2.2 PI3K/mTOR 抑制剂NVP-BEZ235对KG1a 细胞增殖、凋亡及周期的影响
PI3K/mTOR信号通路抑制剂NVP-BEZ235在0、0.125 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L和1.0μmol/L不同浓度下干预KG1a细胞。CCK-8法
检测细胞生长情况显示，NVP-BEZ235抑制KG1a细胞的增殖，且具有时间和剂量依赖性，根据抑制率曲线，NVP-BEZ235在0.25 μmol/L浓度下作用48 h为最佳干预条件，见图3。
图3 MTT
检测不同浓度抑制剂对细胞增殖的影响流式检测NVP-BEZ235在0.25 μmol/L浓度下作用48 h后KG1a细胞周期及细胞凋亡，结果显示，细胞周期阻滞于GO/G1期，导致S期细胞减少；抑制剂NVP-BEZ235没有明显的凋亡诱导作用，见图4。2.3 RT-qPCR 检测KG1a 细胞NKG2D 配体mRNA 相对表达量
水族繁殖
RT-qPCR检测细胞内NKG2D配体MICA、
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MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP1-3 mRNA的相对表达量，结果显示，与对照组相比，NVP-BEZ235干预后，KG1a细胞MICA mRNA相对表达量无显著变化；MICB mRNA相对表达量显著高于对照组；ULBP1、ULBP2、ULBP3 mRNA相对表达量极显著高于对照组，见图5。
注：图中A 为NVP-BEZ235(0.00 umol/L)干预后细胞周期检测结果；B 为NVP-BEZ235(0.25 umol/L)干预后细胞周期检测结果；C 为NVP-BEZ235(0.00 umol/L)干预后细胞凋亡检测结果；D 为NVP-BEZ235(0.25 umol/L)干预后细胞凋亡检测结果
图4 NVP-BEZ235抑制剂对KG1a 细胞周期及凋亡的影响C
A D
B
注：图中NVP-BEZ235与对照组(Control)mRNA 相对表达量相比，*表示差异显著，**表示差异极显著
图5 NVP-BEZ235干预后KG1a 细胞MICA/B 及ULBP1-3 mRNA 的相对表达量
2.4 Western blot 检测KG1a 细胞NKG2D 配体蛋白表达量
Western blot检测细胞内NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP1-3蛋白表达，结果显示，与对照组相比，NVP-BEZ235干预后，KG1a细胞MICA、MICB蛋白相对表达量均无显著变化；ULBP1、ULBP2及ULBP3蛋白表达量极显著高于对照组，见图6。3 讨论
白血病的传统方法主要有化疗和骨髓移植，但其无法解决白血病的愈后复发问题。白血病复发的主要原因在于白血病患者体内存在LSC [7]。由
CD34+CD38-CD123+标记的LSC 96％处于细胞分裂
的休眠期(G0期)，细胞膜高表达ABC泵分子，可将药物泵出细胞外，对药物和放射具有强大的抵抗力，因而其不能被常规的手段所清除[8-9]。LSC 不仅对药物抵抗，同时也能够抵抗免疫细胞的杀伤作用。Paczulla等[3]研究表明，LSC低表达和(或)不表达NKG2D配体，不能通过NKG2D激活免疫细胞是LSC 产生免疫抵抗的主要原因之一。既往研究表明，肿瘤细胞表面NKG2D配体的表达具有可调控性[10-11]。热休克蛋白70抑制剂，丙戊酸和组蛋白去乙酰化酶抑制剂等，均能通过调控肿瘤细胞周期，使细胞表面的NKG2D配体表达上调[15-16]；增强活化免疫细胞对肿瘤细胞的免疫监视作用[12-14]。LSC中PTEN基因缺失，PI3K/mTOR呈持续活化状态，使得PI3K/mTOR 信号通路成为LSC研究的靶点[17-19]。Wang等[20]研究发现，抑制PI3K/mTOR信号通路能调控LSC细胞周期抑制白血病细胞的增殖，而细胞周期的停滞是参与NKG2D配体表达的调控机制之一。Ghorbani等[21]发
现，白藜芦醇可以调节淋巴细胞白血病细胞PI3K下游的Akt通路。阻断PI3K/mTOR信号，可使白血病干细胞停留在细胞周期的G0/G1期，而细胞周期的停滞是参与NKG2D配体表达的调控机制之一[22]。Segovis 等[23]在BaF3髓样细胞系中的研究发现，NKG2D与带有NKG2D配体的靶细胞间偶联物的形成具有PI3K的依赖性，即PI3K可调控NKG2D与其配体的偶连可能调节靶细胞与NK细胞的粘附。本研究结果显示，抑制PI3K/mTOR信号通路后，KG1a细胞增殖明显受到抑制，且细胞周期阻滞于GO/G1期。同时，抑制PI3K/mTOR信号通路后，KG1a细胞NKG2D配体MICB、ULBP1、ULBP2及ULBP3 mRNA相对表达量显著升高，ULBP1、ULBP2及ULBP3蛋白表达量显著升高。NKG2D配体是共免疫细胞识别的重要
注：①图中A 为Western blot 检测图，B 为蛋白表达量统计柱状图；②各检测指标分别与对照组相比，*表示差异显著，**为表示差异极显著
图6 NVP-BEZ235干预后KG1a 细胞MICA/B 及ULBP1-3 蛋白表达量
A B
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靶标，推测PI3K/mTOR信号通路可能通过调控细胞表面NKG2D配体的表达进一步影响其对免疫系统的抵抗。4 结论
NKG2D是NK细胞和T淋巴细胞表面表达的重要免疫受体，LSC细胞NKG2D配体低表达和(或)不表达是其免疫逃逸的重要原因，PI3K/mTOR信号通路参与KG1a细胞周期及增值的调控，并参与调节KG1a 细胞NKG2D配体的表达。推测阻断PI3K/mTOR 信号可能逆转LSC的免疫抵抗作用。此外，需进一步
研究以探索PI3K/mTOR信号通路在清除免疫抵抗的LSC中的作用机制，以期为降低白血病复发提供新靶点。
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