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羊布鲁菌BtpA 和BtpB 基因缺失突变载体

Chinese Journal of Animal Infectious Diseases

中国动物传染病学报收稿日期：

2020-05-25基金项目：

动物布鲁菌新型标记灭活疫苗的研制及临床试验研究（20200402054NC）；“十三五”国家重大科研专项（2016YFD0500900）

作者简介：

乔连江，男，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：

杨艳玲，E-mali：********************2022,30(6):19-26·研究论文·

羊布鲁菌BtpA 和BtpB 基因缺失突变载体的构建及生物

信息学分析

美与丑的世界摘要：为进一步研究布鲁菌IV 分泌系统（T4SS ）效应蛋白BtpA 和BtpB 的分子功能，本研究预构建羊布鲁菌BtpA 和BtpB 基因缺失突变载体，并对其生物学功能进行简单的预测。本研究以羊布鲁菌流行菌

株基因组为模板，分别设计了BtpA 和BtpB 基因上、下游同源臂引物，通过PCR 克隆技术得到了待融合基因片段。采用无缝克隆技术（in-fusion cloning ），将待融合片段与线性化载体PBK-CMV-SacB 连接，经转化、阳性载体的筛选、PCR 鉴定及DNA 测序验证。并利用生信软件对BtpA 和BtpB 进行分析。结果表明：PCR 鉴定和基因测序显示BtpA 和BtpB 上、下游基因片段均成功连接到自杀载体上；生信分析显示，BtpA 和BtpB 序列同源性达99％，不存在信号肽，二级结构以α-螺旋为主，具有良好的反应原性。说明本试验成功构建了羊布鲁菌BtpA 和BtpB 基因缺失突变载体，并对基因结构和功能进行了预测分析，为下一步研究布鲁菌的致病机制奠定了基础。关键词：布鲁菌；Ⅳ分泌系统；无缝克隆技术；生信分析中图分类号：S858.31

文献标志码：A

文章编号：1674-6422（2022）06-0019-08

Construction of the Brucella melitensis BTPA and BTPB Genetic Defect Vectors

and Analysis of Bioinformatics

QIAO Lianjiang, ZHANG Ping, ZHOU Yucheng, YANG Sen, YANG Yanling

(Institute of Special Economic Animal and Plant Sciences, CAAS, Changchun 130000, China)

乔连江，张萍，周玉成，杨森，杨艳玲

（中国农业科学院特产研究所，长春130000）

Abstract: To further study the molecular functions of BtpA and BtpB effector proteins of Brucella Ⅳ secretion system, the aim of the present study was to construct genetic defect vectors of BtpA and BtpB genes of Brucella standard strain 16M effector protein and make a simple prediction of their biological functions. Using the Brucella melitensis genome as a template, the homologous arm primers for the upstream and downstream of the BtpA and BtpB genes were designed respectively and the gene fragments to be fused were obtained by PCR cloning technology. In-Fusion Cloning was used to connect the gene fragments to linearized vectors, which were then veriﬁ ed by transformation, screening of positive vectors, PCR identiﬁ cation and DNA sequencing. The resulting BtpA and BtpB were analyzed using biological software. The results show that the fragment sizes and sequences of the recombinant vectors were identiﬁ ed as expected by PCR. Bioinformatics analysis showed that the BtpA and BtpB sequences were 99% homologous without signal peptide and their secondary structures were mainly α-helix with good reactogenicity. These results indicated the success of construction of the Bt. Mutans BtpA and BtpB gene deletion mutation vectors and prediction of their structure and function, which laid the foundation for the investigation of the pathog

enic mechanism of brucella.Key words: Brucella ; T4SS; in-fusion cloning; bioinformatics

· 20 ·中国动物传染病学报2022年12月

布鲁菌病（简称“布病”）是由布鲁菌属（Brucella spp.）引起的一种严重人畜共患传染病，被列为我国法定传染病中乙类传染病之首[1]。该菌为一种典型的胞内寄生菌，其主要寄生于宿主的单核巨噬细胞中，可引起动物和人持续性感染[2]。近年来，随着我国畜牧业的迅猛发展，动物布病发病率极速攀升，并且人间布病的感染率也达到了历史新高[3]，严重影响了我国畜牧业健康发展，也给公共卫生安全带来了重大隐患。

在布鲁菌（Brucella）诸多毒力因子中，由virB 操纵子所编码Ⅳ型分泌系统（T4SS）是一种关键毒力因子[4]。该系统可跨越细胞膜建立一个转运通道，通过一个类似鞭毛样结构与靶细胞接和，使分泌的效应蛋白到达靶细胞，从而帮助布鲁菌快速适应胞内环境并得以存活。据报道[5]，现已鉴定出布鲁菌T4SS效应蛋白约15种，初步证实了这些效应蛋白被分泌到宿主细胞后，在调控布鲁菌胞内生存、复制方面发挥着重要作用。其中，BtpA和BtpB作为重要的分泌效应蛋白，在布鲁菌感染早期可抑制免疫监视系统、干扰细胞的功能[6]。但是，对于BtpA和BtpB是如何精巧的调节宿主免疫反应的机制还不清楚。为此，本研究以布鲁菌16M基因组为模板，成功构建了布鲁菌BtpA和BtpB基因缺失重组载体。同时，利用分子生物信息学软件对BtpA和BtpB基因的种属间同源性、信号肽、二级结构以及B细胞表位进行预测，为下一步研制布鲁菌诊断试剂和疫苗奠定数据基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器羊布鲁菌16M（Brucella melitensis 16M）为军事兽医研究所保藏惠赠；大肠埃希菌E. coli DH5α感受态细胞购自TaKaRa公司；自杀质粒PBK-CMV-Sac B由军事兽医研究所惠赠；TSA 和TSB培养基购自SIGMA公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、PrimeSTAR® HS DNA Polymerase和2×In-Fusion HD Cloning Kit购自TaKaRa公司；DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；硫酸卡那霉素（Kan）购自上海生工生物工程（上海）科技有限公司；限制性内切酶SmaⅠ购自NEB公司。PCR 基因扩增仪及凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；微量分光光度仪购自Bio-Tek公司；电泳槽设备购自北京六一电泳设备有限公司；摇床购自上海福玛实验设备有限公司。

1.2 PCR引物的设计及合成根据NCBI数据库公布的羊布鲁菌16M BtpA和BtpB基因序列，自杀质粒PBK-CMV-SacB的载体特征及所含酶切位点信息。此外，引物还应满足自杀载体末端序列与融合片段二端具有15 bp的同源碱基。使用Primer Premier 6.0设计引物（小写部分为相邻片段的同源序列），并送长春市库美生物有限公司合成，引物序列见表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

引物名称Primer name

引物序列（5'-3'）

Primer sequence（5'-3'）

片段大小（bp）

Fragment size (bp)

BtpAf-F acttacctggtacccCACCCGCGAACAGCTTGTTTGGG海砂混凝土

835 BtpAf-R TGCATCTGCCGGTGCCCCCATTTGGTCAG

BtpAr-F TGGGGGCACCGGCAGATGCAAATATGGCCG

835 BtpAr-R GGCCCATCGATTTTCCACCCAATGCCCaccttgaccgtacag

BtpBf-F acttacctggtacccCACCCGACGATCTGGTGCCGGAAG

824 BtpBf-R GTAAAGCCTGGAGCCTGTTCCAAAAGTCGCC

BtpBr-F GAACAGGCTCCAGGCTTTACGCTCCCAGC

824 BtpBr-R GGCCCATCGATTTTCCACCCAGCtttatgatgccggcc

SacB-F ACTCAGTACATAATAAAGGAGACAT

1600 SacB-R TGGGATTCACCTTTATGTTGATAAG

1.5 BtpA和BtpB基因上、下游同源臂的克隆以羊布鲁菌16M基因组DNA为模板，分别使用引物BtpAf-F/ BtpAf-R和BtpAr-F/ BtpAr-R、BtpBf-F/ BtpBf-R和BtpBr-F/ BtpBr-R进行PCR扩增。PCR反应体系（50 μL）：5×PrimerSTAR Buffer 10 μL，dNTP MIX 4 μL，PrimerSTAR HS DNA Polymerase

· 21 ·

乔连江等：羊布鲁菌BtpA 和BtpB 基因缺失突变载体的构建及生物信息学分析第30卷第6期0.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH 2O补全。扩增程序：98℃预变性6 min；98℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35个循环；72℃再延伸10 min，4℃保存。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，胶回收后，送长春市库美生物有限公司进行测序分析。

1.6 自杀质粒PBK-CMV-SacB 线性化于-80℃冰箱取出保存的自杀质粒PBK-CMV-Sac B，经Sm aⅠ单酶切消化后，进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。1.7 采用无缝克隆技术，构建重组载体以分光光度法测定待融合片段和线性载体的浓度，按照TaKaRa 公司无缝克隆重组酶（In-Fusion Cloning）说明书设计反应体系，载体与各插入的片段的最佳摩尔比为1∶2，分别构建了BtpA和BtpB重组自杀载体。将该连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，按TaKaRa 公司质粒载体转化方法进行操作。取150 μL转化产物，均匀涂布于含卡那（Kan）抗性的LB固体培养基上，37℃培养10~12 h，挑取单菌落进行PCR鉴定，并将阳性产物测序鉴定。此外，对阳性产物进行SacB基因的PCR检测。将验证正确的产物分别命名为PBK-CMV-Sac B-ΔBtpA和PBK-CMV-SacB-ΔBtpB，于-80℃保存，并使用DANMAN软件绘制构建重组载体的简图（图1，图2）。

1.8 BtpA 和BtpB 基因的分子生物学预测利用分子生物学软件DNAStar、SignaIP-4.1Server和NCBI网上数据库等，对羊布鲁菌效应蛋白BtpA和BtpB进行了基因序列同源性，信号肽、二级结构以及抗原表位的深入分析。

2 结果

2.1 BtpA 和BtpB 上、下游同源臂的PCR 扩增以羊布鲁菌16M基因组为模板，利用上、下游同源臂引物分别获得了BtpA上、下游同源臂片段（835 bp）和BtpB上、下游同源臂片段（824 bp）。其测序结果显示未出现碱基突变，碱基序列与模板完全一致（图3，图4）。

2.2 自杀质粒PBK-CMV-Sac B 酶切鉴定对自杀质粒PBK-CMV-Sac B进行单酶切鉴定，PCR结果显示，单酶切后质粒上移，与预期大小相符，说明自杀质

粒酶切成功（图5）。

2.3 重组载体鉴定将转化产物，用特异性引物进行PCR鉴定，结果显示：BtpA上、下游同源臂片段和BtpB上、下游同源臂片段分别插入了载体（图6，图7）。重组质粒的测序结果也验证了待融合片段成功整合到了自杀质粒PBK-CMV-Sac B上。此外，对验证正确的产物进行了Sac B基因的检测，得到了

邵峰晶

1600 bp的条带（图8）。

图1 重组质粒PBK-CMV-SacB-ΔBtpA

Fig.1 Recombinant plasmid PBK-CMV-SacB-ΔBtpA

图2 重组质粒PBK-CMV-SacB-ΔBtpB

Fig.2 Recombinant plasmid PBK-CMV-SacB-ΔBtpB

· 22 ·中国动物传染病学报2022年12月

图3 上游同源臂BtpAf 和下游同源臂BtpAr 的PCR 结果

Fig.3 The electrophoresis result of PCR product of upstream homology arm BtpAf and downsteam homology

arm BtpAr

M: DNA 相对分子质量标准（DL2000）; 1~2: BtpAf 片段;

3~4: BtpAr 片段; 5: 阴性对照

M: DL2000 DNA marker; 1-2: BtpAf fragment; 3-4: BtpAr

fragment; 5: Negative control

图4 上游同源臂BtpBf 和下游同源臂BtpBr 的PCR 结果Fig.4 The electrophoresis result of PCR product of upstream homology arm BtpBf and downsteam homology

arm BtpBr

M: DNA 相对分子质量标准（DL2000）; 1-2: BtpBf 片段;

3~4: BtpBr 片段; 5: 阴性对照

M: DL2000 DNA marker; 1-2: BtpBf fragment; 3-4: BtpBr

fragment; 5: Negative control

图5 自杀质粒PBK-CMV-SacB 酶切鉴定结果Fig.5 Restriction map of Recombinant plasmid

PBK-CMV-SacB

M: DNA 相对分子质量标准（DL8000）; 1: 未酶切质粒;

2~3：单酶切质粒

M: DL8000 DNA marker; 1: Undigested plasmid; 2-3: Digested

plasmid

2.4 BtpA 和BtpB 分子生物信息学方法的预测2.4.1 BtpA 和BtpB 基因序列分析在NCBI数据库上，搜索布鲁菌不同种属、不同生物型的BtpA 和BtpB 基因序列，经线上BLAST软件比对分析后，发现其核苷酸同源性均在99%以上。表明了BtpA 和BtpB 基因在布鲁菌中差异性极小、高度保守。

2.4.2 BtpA和BtpB信号肽及其切割位点的预测在NCBI线上数据库下载羊布鲁菌BtpA和BtpB的氨基酸序列。并利用线上软件SignaIP-4.1Server对BtpA和BtpB氨基酸序列的信号肽及其切割位点进行预测。软件通过计算分析得到效应蛋白BtpA和BtpB均不具有信号肽，分别在21和60位氨基酸处存在切割位点（图9，图10）。

2.4.3 BtpA和BtpB二级结构的预测将BtpA和BtpB 氨基酸序列导入DNAStar软件包中protean，按照Garnier-Robson Chou-Fasman 及Karplus-Schulz方法进行二级结构的解析预测。结果可知，效应蛋白BtpA和BtpB均具有α-螺旋、β-折叠及无规则卷曲等

丰富的二级结构。同时分析到柔性结构区域在BtpA

M 1 2 3 4 5

M 1 2 3

M 1 2 3 4 5

· 23 ·

乔连江等：羊布鲁菌BtpA 和BtpB 基因缺失突变载体的构建及生物信息学分析

第30卷第6期N-端的5-14、18-41、44-65、69-75、79-88、92-118、124-134、139-143、151-157、167-169、182-198、210-212、216-220、226-231、242-254、259-265处，而在BtpB N-端的8-14、31-46、52-55、65-69、77-82、123-131、134-138、139-147、163-170、182-183、189-192、198-206、211-214、222-230、245-248、255-259、265-269、274-279处，在柔性结构区域易于形成抗原表位（图11，图12）。

收费站2.4.4 BtpA和BtpB B细胞抗原表位的预测按照算法Kyte-Doolittle、Emoni及Jameson-Wolf分别对蛋白的亲水性、表面可及性和抗原性进行了预测，结果如图13所示。对B细胞抗原表位的预测，需将蛋白的二级结构柔性区域、亲水性、表面可及性和抗原性作综合分析。结果显示，极有可能是B细胞抗原表位的分别是BtpA N-端5-13、18-40、49-65、79-88、92-101、139-143、151-157处，以及BtpB N-端8-14、31-39、189-192、223-230、246-250处。

图6 重组载体PBK-CMV-SacB-ΔBtpA 的PCR 鉴定

Fig.6 The electrophoresis result of PCR product of Recombinant plasmid PBK-CMV-SacB-ΔBtpA

M: DNA 相对分子质量标准（DL2000）; 5、7、17、19: BtpA 融合片段的PCR 扩增产物

M: DL2000 DNA marker; 5, 7, 17, 19: The electrophoresis result of PCR product of BtpA fusion fragments

形容词作状语

图7 重组载体PBK-CMV-SacB-ΔBtpB 的PCR 鉴定

Fig.7 The electrophoresis result of PCR product of recombinant plasmid PBK-CMV-SacB-ΔBtpB

M: DNA 相对分子质量标准（DL2000）; 5、11、19、20: BtpB 融合片段的PCR 扩增产物

M: DL2000 DNA marker; 5, 11, 19, 20: The electrophoresis result of PCR product of BtpB fusion fragments

图8 重组载体SacB 基因的PCR 鉴定Fig.8 The electrophoresis result of PCR product of

recombinant plasmid SacB gene

M: DNA 相对分子质量标准（DL2000）; 1：阴性对照; 2~3: PBK-CMV-SacB-ΔBtpA SacB 基因PCR 扩增产物; 4~5: PBK-CMV-SacB-ΔBtpB SacB 基因PCR 扩增产物M: DL2000 DNA marker; 1: Negative control; 2-3: The electrophoresis result of PCR product of PBK-CMV-SacB-ΔbtpA

SacB gene; 4-5: The electrophoresis result of PCR product of

PBK-CMV-SacB-ΔBtpB SacB gene

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

郑筱萸bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

bp 2 1 M

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