!#hUWumf-MeKW l f2020，Dyc；39(6)：800可°5 -800-
.论著.
苏艾荣，许金金，蒋秀琴
(南京医科大学第二附属医院临床分子基因检测中心，江苏南京210003)
&摘要］目的：探讨牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)对小鼠急性肝损伤的保护机制(方法：采用小鼠腹腔注射四氯
化碳(CC14f诱导急性肝损伤动物模型，通过测定血清转氨酶变化及观察肝组织切片HE染，检测TUDCA 对小鼠急性肝损伤的保护效果；采用硫代酸(TBA)法检测血清中丙二醛(MDA)的含量及轻胺法检测
血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用蛋白免疫印迹、PCR等方法检测肝组织中免疫球蛋白重链结合
蛋白(BR)、肌醇需求酶1(IRE1)*c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白以及X盒结合蛋白1(XBP1)基因转录表达的
变化，分析TUDCA对急性肝损伤的保护机制。结果:TUDCA显著保护由CC14中毒引发的肝组织病变，与单
独急性肝损伤相比,TUDCA预处理显著增强肝组织的抗氧化水平，并抑制内质网应激程度。结论:TUDCA
通过抑制由CC3中毒引发的内质网应激和氧化应激，对急性肝组织损伤具有显著保护作用。
&关键词］牛磺熊去氧胆酸；肝损伤；内质网应激；肌醇需求酶1；小鼠
&中图分类号］R-33&文献标识码］A&文章编号］1671-6264(2020)06-0800-06
dob10.3969/j.bsn.1671-6264.2020-06-017
TUDCA alleviates acute liver injury in micc inducet by CCl N
treatment by inhioiting ER stress and oxCative stress
SU Airong，XU Jinjin,JIANG Xiuqin
(Clinical Molecular Diagnostio Laboratoro，the Second Ailiatep Hospital lp Nanjing MePical University，
Nanjing210003，China)
&Abstract］Objective:To investigate the hepatopetective mechanisms of taueursodeoxycholic aT6(TUDCA)on acute liver injue W mice induced by carbon tetrachloide(CCI4)-Methods:The acute hepatotoxicity model was induced by intrapeitoneal injection of CCI4in mice.To investigate the protective effect of TUDCA on hepatic injury，the activities of alanine aminotransferase(ALT)and aspaiate aminotransferase(AST)were characterized and
the tissue sections were analyzed by haematoxylin-eosin(H&E)stain.To further explore the potential protective mechanisms of TUDCA on hepatic injue，we measured the contents of malondialdehyde(MDA)，the activity of superoxide dismutase(SOD)in mice sxum，and analyzed the expressions of binding immunoglobulin protein(Bip)，inositod equibng kinase1(IRE1)，cJUN N temiinal kinase(JNK)and X-box binding protein-1(XBP1)-
&收稿日期］2019-08-26&修回日期］2020-11-17
&作者简介］苏艾荣(1978-)，女，内蒙古商都人，讲师，理学博士。E-mai1:suabong@njmu.cdu
&通信作者］蒋秀琴E-maii:2316799507@qq
&引文格式］苏艾荣，许金金，蒋秀琴.TUDCA通过抑制内质网应激及氧化应激减轻CC14所致小鼠急性肝损伤&J］-东南大学学报(医学版)，2020，39(6):800:805.
苏艾荣，等.TUDCA通过抑制内质网应激及氧化应激减轻CC14所致小鼠急性肝损伤-801-
Results:Hepatic steatosis was obseeed in the livers of CCI4treated mice as compared to the control geup,whereas the mice pretreated w ith TUDCA showed approximately nomiat liver architecture.TUDCA inhibited the elevated ALT and AST activities and decreased the accumulation of ROS.In addition,CCdPnducX ER stress in mice livers could be inhibited by TUDCA.Conclusion:TUDCA deviates CCI4-induced acute liver injuies by reducing ROS accumulation and by suppression of the ER stress-
&Key words]taueursodeoxycholic add;liver inju-；endoplasmic reticulum stress;inosLol-requiwng kinase 1；mice
肝脏是内源性及外源性化合物转化代谢的主要场所。药物服用剂量不当、不慎摄入毒物、病毒感染以
及大量饮酒均会导致肝功能的急性损伤。急性肝损伤如果不能得到及时有效的会引发严重的、不可逆转的后果，诸如肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。四氯化碳(CC3)诱导小鼠或者大鼠肝损伤是一种广泛使用的急性、慢性肝损伤动物模型，可以用来评价药物对肝损伤的保护作用及其机制&1］。CC3引起肝损伤的发病机制，主要是通过细胞素p450系统导致自由基产生&2］(研究发现，当细胞受到自由基攻击时，内质网膜受损导致细胞内钙离子稳态失衡进而引发内质网应激(endoplasmic reticulum stress)，内质网应激发生后可以进一步加重细胞内自由基的产生，导致细胞损伤更加严重［3］(
牛磺熊去氧胆酸(taueursodeoxycholic acid，TUD-CA)是一种广泛存在于人类和动物体内的天然结合型胆汁酸。已有的研究表明，TUDCA促进胆汁酸的分泌和转运，对CC3诱导的肝纤维化具有抑制作用⑷。Ozcan等&5］的研究发现,TUDCA通过调节内质网应激信号通路恢复2型糖尿病小鼠的血糖稳态。Hassan 等&6可］的研究结果显示，TUDCA抑制流感病毒及呼吸合胞病毒的，病毒是调节质网应激信号通路发挥作用。本研究复制了急性肝损伤的小鼠模型，观察TUDCA对CC3所致急性肝损伤是否有作用，并进一步探究其可能的机制，为临床从内质网应激角度急性肝损伤提供实验依据。
1材料与方法
1.1材料
实验动物与分组：健康4周龄雄性BALB/e小鼠24只，体重20~25g，购于南京大学模式动物所。动物饲
养于室温［(22±2)C］，于实验前适应性饲养1周，随机分为对照组、CC3组、TUDCA预处理组3组，每组8只。TUDCA(PubChem CIN：101593705)购自Sigma-Aldich( sigma，美国)；CCI4(分析纯级)购自南京生兴生物技术有限公司；放射免疫沉淀法缓冲液(RICA)、甘油醛可-磷酸脱氢酶(GAPDH)及c-Jun氨基末端激酶！cJUN N-Weninal kinase，JNK)2抗鼠单克隆抗体购自Santa Cruz(Santa Cme，美国)；特异性免疫球蛋白重链结合蛋白(binding immunoglobulin patein，Bip)、肌醇需求酶1(inositol-requiring kinase1，IRE1)和磷酸化JNK(p-JNK)抗体购自Cel l Signaling Tech-nology(Beverly，美国)。抗磷酸化IRE1兔单克隆抗体购自Abeam(Cambidge，美国)。
1.2方法
1.2.1造模及给药方法TUDCA预处理组小鼠按照250mg-kg-1腹腔注射TUDCA，早8:00与晚8：00分别注射1次，一日总剂量为500mg-kg'1，共持续7d；CC14组及对照组小鼠给予同样体积的生理盐水。用玉米油和CC3按照1:1比例配制CC14油溶液，在第7天TUDCA腹腔注射2h后,TUDCA预处理组及CC14组小鼠均按照1ml-kg"腹部皮下注射CC3油剂，对照组同样方法给予同样剂量的生理盐水，所有实验动物自由饮水、摄食。
1.2.2取材CC3注射后24h用1%钠麻醉动物，腹主动脉取血,4C过夜,3000r-min-1离心留取血清，存放于-20C备用；留取同样部位肝脏(右叶)标本，分为3份备用：1份置于4%多聚甲醛溶液中固定,
72h后进行石蜡包埋，制作病理切片；另外2份迅速置于液氮中，随后转移至-80C保存，分别用来提取总RNA及总蛋白的后续检测。
1.2.3血清丙氨酸氨基转移酶(AST)和天冬氨酸氨基转移酶(ALT)检测微板法检测血清AST及ALT 含量，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，实验方法参照说明书。
1.2.4血清丙二醛！MDA)及总超氧化物歧化酶(SOD)水平检测通过检测血清中MDA和SOD含量，反映CC3所致的肝组织中细胞膜脂质过氧化程度，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，实验方法参照说明书。
1.2.5RNA提取、PCR和实时荧光定量PCR分析
使用TRIzol试剂！Life Technologies，美国)提取肝组织
-802-东南大学学报（医学版）2020年12月，39（6）
中的总RNA，取1"g总RNA在20"反应体系中采用反转录PCR试剂盒（TOYOBO，日本）进行反转录。PCR所用引物序列为:X盒结合蛋白1（X-boa bCiding protein1,XBP1）：上游5'-GAACCAGGAGTTAAGAA CACG-3-，下游5-AGGCAACAGTGTCAGAGTCC-3-内参基因GAPDH：上游5-GCCGGACTCATCGTACTCC-3-，下游5-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3-实时荧光定量P
CR设置3个复孔，所用引物:Bip：上游5-ACTTGGGGACCACCTATTCCT-3'，下游5-ATCGCCAA TCAGACGCTC C-3'；GAPDH：上游5-TGAACGGGAAG CTCACTGG-3'，下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3-
1.2.6蛋白免疫印迹实验小鼠肝组织匀浆后使用RIPA裂解液在冰上裂解30mX,4a*12000x g离心10mix，取上清，使用BCA蛋白定量试剂盒（Pierce，美国）进行总蛋白定量检测。分别取60"g总蛋白变性，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，蛋白转印到PVDF（Milti-pie，美国）膜上，室温封闭1h,—抗4a孵育过夜, PBST洗涤后加入荧光标记的二抗孵育1h,PBST洗涤后在Odyssey（LN COR，美国）仪器扫描显示结果。
1.3统计学处理
采用SPSS18.0进行统计分析，数据以&表示，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间比较采用LSD法,@<0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2-1TUDCA对小鼠急性肝损伤的保护作用
为了检测TUDCA预处理对小鼠肝组织损伤的作用，本实验检测了小鼠血清中ALT和AST的活力，结果
显示,CC-组小鼠血清ALT和AST活力显著上升（表1）（与CCl4组相比较,TUDCA预处理组小鼠血清ALT和AST活性降低具有统计学意义（图1A、B）。肝脏HE染进一步显示TUDCA预处理对肝细胞损伤的保护作用：对照组小鼠肝细胞以中央静脉为中心向四周呈放射状整齐排列，组织结构完整（图1C）；CC-组小鼠肝细胞排列紊乱，显示弥漫性脂肪变性，大量空泡形成（图1D）；TUDCA预处理组小鼠肝细胞排列接近对照组，结构相对完整，未见明显的肝细胞脂肪变性（图1E）O以上结果提示,TUDCA预处理对CC-所致的急性肝损伤具有显著的保护效果（
2.2TUDCA预处理减轻自由基对小鼠肝组织的攻击
表2显示，与单独的CC-作用相比,TUDCA预处表1各组小鼠血清ALT和AST活性比较!！±s,#=8）组别ALT活性/U•L1AST活性/U•L"
2009全美音乐奖
照组22.3±5.815.7±2.4
CCi4组150.6±9.7c138.4±8.3c TUDCA预处理组103.8±10.6b110.4±7.2b C值420.92777.88
@值0.000.00 a与对照组比较,@<0.05；b与CCl4组比较,@<0.05
理显著降低了血清MDA含量（图2A），提升了血清SOD活性！F=749.87,@<0.05，图2B）。结果提示, TUDCA显著减少了由CCI在肝脏代谢中产生的自由基，从而缓解自由基对肝组织的损伤。
2-3TUDCA预处理抑制CC-刺激产生的内质网应激因为BX的表达变化可以作为内质网应激发生的标志［8］，因此本研究检测了各组小鼠肝脏组织细胞中Bip的表达。与对照组比较,ccy组小鼠肝组织中Bip 的蛋白和基因表达均显著升高，而TUDCA预处理组小鼠肝组织中的Bip表达接近对照组（图3），提示TUDCA预处理显著抑制了CC-急性肝损伤所致的内质网应激程度。
2-4TUDCA预处理抑制CC-对IRE1信号通路的激活内质网应激发生时，在Bip表达升高的同时，往往伴随下游信号通路的激活。本研究进一步检测了内质网应激发生时激活的IRE1的变化。IRE1的磷酸化程度代表该通路的活化程度，CC-组小鼠肝组织中磷酸化IRE1蛋白比例明显增加，与之相比,TUDCA预处理组小鼠肝组织中IRE1磷酸化水平显著降低（图4A）。为了进一步证实TUDCA预处理对IRE1信号通路的影响，我们检测了IRE1下游信号分子的变化情况。IRE1核酸内切酶活性剪切XB@1（unspliced XBP1, XBP1'）成为剪切型XB@1（spliced XBP1,XBP1s）⑼。由图4B可以看出，CC-组小鼠肝组织中XB@1u被剪切为XB@1s，而TUDCA预处理组未检测到XB@1s，进一步证实TUDCA预处理抑制了IRE1的激活；此外，本研究还检测了IRE1激酶活性的变化情况。IRE1激酶活性激活时，可以通过募集肿瘤坏死因子受体相关因子-2（TRAF2）蛋白进而激活JNK分子，诱导细胞凋亡［10］（本研究结果显示,CCl4处理组小鼠肝组织中JNK分子显著激活，而TUDCA预处理组未检测到JNK 通路的激活（图4C）。总之以上结果提示,TUDCA预处理可以有效抑制由CCl4所致的IRE1信号通路的激活。
苏艾荣，等.TUDCA 通过抑制内质网应激及氧化应激减轻CC14所致小鼠急性肝损伤
澳门科技大学2020年本科招生
-803 -
图1 TUDCA 预处理对CCl 4所致急性肝损伤的保护效果 A 、B.各组小鼠血清中ALT （ A ）及AST （B ）活性比较;a 与对照组比较,
@<0.05 ；b 与CC3组比较,@<0.05 ；C 〜E.对照组（C ）、CC3组（D ）、TUDCA 预处理组（E ）小鼠肝组织HE 染结果（x400）
表2 各组小鼠血清SOD 活性和MDA 含量比较
示波仪（x ±s ,# =8）
a 与对照组比较,@<0.05 ；
b 与CC3组比较,@<0.05
组另」MDA 含量/n mol •m31
SOD 活性/U ・mD 1
领导艺术论文
照组
11.9 ±0.5
82.5 ±5.7
CC3组
23.4 ±2. 0c 39.5 ±7.2c TUDCA 预处理组
11.3 ±0.4b 150. 1 ±3.8b C 值248.97
749.87
@值
0.0040.00
3讨 论
旋转机械故障诊断
药物或有毒物质在经
脏 的过程中会
细胞产生直接或者间接的
，诱发肝细胞发生 .
激或凋亡，最终
细胞脂质 、脂肪 性以
（ccy 是常用的 性
物模型的
一 合物， 的病理过程与 所见多
种原因所 、慢性
程类似&⑴。已 研究发
:TUDCA' 质网应激从 吸道
合胞病毒及禽流感病毒的 &6可';TUDCA a 与对照组比较,@<0.05 ；b 与CC3组比较,@<0.05
持久收入假说图2 TUDCA 预处理对CCI 4所致肝组织氧化应激的保护效果 各组小鼠血清MDA 含量（A ）及SOD 活性！ B ）
的比较
-804-东南大学学报（医学版）2020年12月，39（6）
*
#!*
蚤
VNHE
对照组CCh组TUDCA预处理组
a与对照组比较,@<0.05；b与CC3组比较,@<0.05
图3TUDCA预处理对CCl所致内质网应激的影响各组小鼠肝细胞中Bip基因（A）及蛋白（B）的表达
XBP1u”
XBPls
B
图4TUDCA预处理对CCl所致IRE1信号通路的影响 A.各组小鼠肝组织中非磷酸化及磷酸化IRE1的表达；B.各组小鼠肝组织中IRE1核酸内切酶对XBP1剪切的结果；C.各组小鼠肝组织中JNK分子的激活程度
质网应激，糖尿病小鼠胰腺细胞分泌血糖的功能&5'（本研究探究TUDCA预处理性的保护作用，实验结果显示,TUDCA预处理组小鼠在接受ccy注射功能微，各项指标均接近对照组小鼠，TUDCA预处理性好的保护作用。Bip的表达升高是内质网应激发生的标志&12', TUDCA预处理显CC3所Bip的升高。IRE1是内质网应激发生时激活的通路之一,TUDCA 预处理显CC3所IRE1信号的激活。
结TUDCA预处理CC3所引起的质网激，一能是TUDCA CCa4所
的小鼠急性程度的原因之一。
产生的活性氧自由基对肝组织中细胞膜的损伤是ccy所 的主要&13研究，TUDCA强细胞的能&14'。本研究显示，与CC3组，TUDCA预处理组小鼠血清中的SOD活性显著上升，脂质产物MDA含量接近对照组，TUDCA预处理有助强细胞对自由基的清除能力，最终减轻ccy所致的小鼠肝组织中细胞的程度。
激与内质网应激之着密切的联系&⑸。病理诱发的激刺激内质网应激发生&16'，质网应激发生刺激［应激的发生&⑸。推质网应激与激之互的正反馈关系。目大〔对TUDCA的研究均聚焦质网应激方面的功能，作为一显质网应激的化合物，其激程度的完全阐明。本研究结，TUDCA预处理不但显ccy所的内质网应激，CCa4所的激性程度显的
作用。依本研究结推测，ccy脏•产生各类自由基细胞的过程中激活质网激，内质网应激发生一步增加各类自由基的产生，加组织中细胞脂质，TUDCA 质网应激的发生，质网应激
激信号的激活这一恶性循环，最终细胞发
护
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