四川大学学报（医学版）2021, 52 (3 ) : 402 _408
J Sichuan Univ(Med Sci)doi: 10.12182/20210560204
•论著.
m6A结合蛋白Y T H D C2对人骨髓间充质干细胞分化的影响 文俊儒，谭震，林讳民，李奇文，袁泉&
口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院种植科（成都610041)
【摘要】目的研究N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine，m6A)结合蛋白YTH结构域蛋白2(YTH domain- containing protein 2, YTHDC2) 对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs) 成骨及成脂 分化的调控。方法通过小干扰RNA(siRNA)体外对hBMSCs进行y：THDC2基因表达的敲降，并进行成骨及成脂诱导分 化，以研究1THDC2敲降后hBMSCs分化表型的改变。利用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染和茜素红染鉴定 成骨活性和钙结节形成，尼罗红染检测脂滴形成。利用荧光定量PCR(RT-qPCR)检测成骨和成脂相关基因的表达。通 过RNA测序(RNA-seq)分析>THDC2敲降后的转录组变化，探索YTHDC2调控hBMSCs分化的潜在机制。结果敲降 rr aD C2促进hBMSCs成骨分化中的ALP活性及钙结节形成，并显著上调成骨相关基因表达；同时降低了hBMSCs在成脂分 化中的脂滴形成能力，并显著下调成脂相关基因表达。RNA-seq的基因富集分析显示YTHDC2与核糖体功能及mRNA翻译有关信号通路显著相关。结论敲降1THDC2可促进hBMSCs成骨分化，抑制成脂分化。敲降1THDC2可能造成核糖体 功能改变。
【关键词】YTH结构域蛋白2 人骨髓间充质干细胞N6-腺苷酸甲基化成骨分化成脂分化
Role of m6A Reader YTHDC2 in Differentiation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells WEN Jun-ru，TAN Zhen，LIN Wei-min，LI Qi-wen，YUAN QuanA. State Key Laboratory of Oral Diseases，National Clinical Research Center f or Oral Diseases, Department of D ental Implant, West China Hospital of S tomatology, Sichuan University^ Chengdu 610041，China
A Corresponding author, E-mail：****************
【Abstract】Objective To study the regulatory effect of YTH domain-containing protein 2 (YTHDC2), a member of N6-methyladenosine (m6A) readers, on the osteogenic or adipogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs). Methods YTHDC2expression was knocked down by small interfering RNA (siRNA) in vitro.Osteogenic differentiation and adipogenic differentiation of hBMSCs were induced after YTHDC2 knockdown in order to study the changes in t
he differentiation phenotype of hBMSCs. Alkaline phosphatase staining (ALP staining) and alizarin red S staining were performed to examine osteogenic activity and calcium-nodular formation.
Nile red staining was performed to examine lipid-droplet formation. Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was used to assess the expression of osteogenesis and adipogenesis-related genes. RNA-sequencing was performed to identify the transcriptome changes after YTHDC2knockdown and to explore the potential regulatory mechanism by which YTHDC2 regulated the diferentiation of hBMSCs. Results In this study, we found that siRNA- induced YTHDC2knockdown resulted in increased ALP activity and calcium-nodular formation of hBMSCs during osteogenic differentiation, and significantly upregulated the expression of osteogenesis-related genes. In addition, the lipid-droplet formation capacity of hBMSCs was decreased during adipogenic differentiation. The expression of adipogenesis-related genes was significantly down-regulated. Gene-set enrichmen analysis of RNA-seq data showed that YTHDC2 was significantly correlated with ribosome function and mRNA-translation-related signaling pathways.
Conclusion The findings indicate that YTHDC2 knockdown can promote the osteogenic differentiation of hBMSCs and inhibit the adipogenic differentiation. YTHDC2 knockdown may cause changes in ribosome function.
【Key words】YTH domain-containing protein 2 Human bone marrow mesenchymal stem cells N6- methyladenosine Osteogenic differentiation Adipogenic differentiation
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种在骨髓中广泛存在的干细胞，它可以 多向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或造血支持 基质[12]。BMSCs在成骨和成脂分化方向的命运决定影响
A 通信作者，E-mail:**************** 着骨豁健康13|d N6-腺苷酸甲基化(N6-methyladenosine，m6A)修饰是真核生物体内mRNA上最广泛的一种表观遗 传修饰。该修饰表现为腺嘌呤六号N原子上的甲基化〜1。近年来，研究揭示了 m6A修饰在哺乳动物细胞中的一系 列生理作用，包括调控mRNA剪切、出核、成熟、翻译、肿
第3期文俊儒等:m6A结合蛋白Y T H D C2对人骨髓间充质干细胞分化的影响403
瘤代谢以及细胞增殖分化等|71。m6A修饰需要多种蛋白 复合体的参与，包括m6A“写码器”甲基转移酶、“消码器”去甲基化酶和“读码器”m6A结合蛋白。其中，甲基转移酶 介导在mRNA上添加m6A修饰，去甲基化酶介导m6A修饰 的清除,m6A结合蛋白可以特异性识别m6A修饰181。本课 题组前期研究发现了 m6A甲基转移酶3(methyltransferase-like 3, METTL3)介导的m6A修饰对BMSCs分化的调 控|91。而作为m6A代谢中的重要一环，目前缺乏m6A结合 蛋白调控BMSCs分化的研究"°1。
m6A结合蛋白包括YTH N6甲基腺苷RNA结合蛋白1、2、3(YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3)，YTH结构域蛋白 (YTH domain-containing protein)1、2 (YTHDC1、YTHDC2)。其中，YTHDC2是YTH家族中最新发现的蛋白。YTHDC2 广泛分布于真核生物胞质内，可通过YTH序列特异性识 别并结合m6A，从而促进mRNA的翻译并影响mRNA的稳 定性U11。研究表明，YTHDC2对维持减数分裂及生殖细 胞的产生至关重要112"41，并参与多种疾病的发生发展，包 括：自闭症、胰腺癌、结肠腺癌、肝癌、肺腺癌和头颈部 鱗状细胞癌|15_2°]。而YTHDC2如何调控BMSCs的命运决 定尚不清楚。本研究的目的是探究YTHDC2对人骨髓间 充质干细胞(hBMSCs)成骨和成脂分化的影响及其作用 机制。
1材料和方法
1.1细胞培养
流量生成hBMSCs原代细胞系（ATCC® PCS-500-012)购自 American Type Culture Collection。hBMSCs具有多向分 化潜能。我们将hBMSCs细胞悬浮液转移至培养皿中，采 用a-MEM(Gibco)培养基进行培养。培养基中添加10% 胎牛血清(Gibco)，100 U/mL青霉素(Gibco)及 100 |ig/mL 链霉素(Gibco)。培养条件为37 T：、体积分数5%C02，每 2 d更换1次培养基每6 d进行1次传代。每次传代采用胰 酶重悬细胞，按lxlO V cm2的密度均匀铺在培养皿中。hBMSCs在传代至第3、4代时增殖活性较强，细胞形态为 纺锤状，因此本研究采用第4代hBMSCs进行后续实验。1.2 siRNA转染试验
使用si-y77fDC2(Santa Cruz Biotechnology,sc-91804)及标准对照 s i-CTRL(Sangon Biotech)对 h BMSCs进行转染。转染试剂为50 nmol/L Lipofectamine™RNAiMAX (Invitrogen)溶于无血清Opti-M EM*I Medium(Invitrogen)。hBMSCs在无抗生素培养基内培养24 h后，加人含si-或si-CTRL的转染试剂，在37 T、体积分数5%(：02下孵育12 h换液。转染后48 h，使用ym D C2成品引物(Santa Cruz Biotechnology,sc-91804-PR)通过焚光定 量PCR(RT-qPCR)检测y r a r»C2表达(具体方法见1.5)，并 计算si-y m〇C2转染hBMSCs的敲降效率。
1.3 hBMSCs成骨分化诱导实验
经siRNA转染的hBMSCs在成骨诱导液中培养进行成 骨诱导分化。成骨诱导液以a-MEM培养基为溶剂，含 100 nmol/L地塞米松(Sigma)、50 |ig/mL抗坏血酸(Sigma)、5 mmol/L(3-甘油磷酸(Sigma)、10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 H g/mL链霉素。碱性磷酸酶(ALP)活性是早 期成骨的重要标志|211。细胞在24孔板中成骨诱导7 d后进 行ALP染：PBS洗涤孔板3次，多聚甲醛固定20 min，再 用ALP染液(Beyotime Biotechnology)避光解育20 min使其 显，去除染液后PBS洗涤孔板3次，采集图片。hBMSCs 成骨诱导3、7 d后进行ALP定量：细胞经胰酶消化后使用 超声裂解，离心后吸取上清液，采用BCA蛋白检测试剂盒 (Beyotime Biotechnology)通过562 nm处吸光度值测定样 本蛋白浓度。按ALP检测试剂盒(Beyotime Biotechnology)说明书操作，测定样本520 nm处吸光度值。ALP=(样品 吸光度值-空白孔吸光度值)八标准孔吸光度值-空白孔 吸光度值）x酶标准品浓度/样本蛋白浓度。上式
中，ALP单位为U/g protein，酶标准品浓度为0.02 mg/mL，样本蛋白浓度单位为g protein/mL。
茜素红染检测成骨中后期细胞沉积钙盐并形成钙 结节的能力1221。hBMSCs在24孔板中成骨诱导14 d后进行 茜素红染:PBS洗涤3次，多聚甲醛固定20 min，再使用 茜素红染液(Solarbio Technology)避光孵育30 min使其显 。显后用10%氯化十六烷基吡啶处理15 min，在562 nm 处测定吸光度，通过对比钙浓度标准曲线进行定量测定。
hBMSCs在成骨诱导3、5、7 d后进行成骨相关基因的 RT-qPCR检测，包括distal-less homeobox 5(DLX5)、RUNX family transcription factor2(R U N X2) ^Sp7 transcription factor(SP7)、collagen type I alpha 1 (C O L l A l) ^bone gamma-carboxyglutamate protein (BGLAP)和secreted phosphoprotein 1(SPP1)。具体方法 见后文1.5。
1.4hBMSCs成脂分化诱导实验
将hBMSCs转染后在成脂诱导液中进行成脂诱导分 化。成脂诱导液以DMEM高糖培养基为溶剂，含1mmol/L 地塞米松、4 mg/mL胰岛素(Sigma)、50 mmol/L3-异丁基-卜甲基黄嘌呤(IBMX)、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素 和100 H g/mL链霉素。尼罗红染：细胞在96孔板中成脂 诱导28 d后,PBS洗漆孔板3次，多聚甲醛固定20 min，再使 用尼罗红荧光染料(Genmed)避光孵育10 min后显，PBS
404四川大学学报(医学版)第52卷
洗涤3次，于荧光显微镜下观察脂滴，对成脂表型进行鉴定。
hBMSCs在成脂诱导3、5、7d后进行成脂相关基因的 RT-qPCR 检测，包括CCA AT enhancer binding protein alpha(C£B P a)、perilipin “P U N l)和 lipoprotein lipase(LPi)。具体方法见 1.5。
1.5 RT-qPCR检测成骨、成脂分化相关基因表达
使用TRIzol试剂（Invitrogen)提取总RNA，使用 PrimeScript RT试剂盒（TaKaRa)和gDNA eraser试剂盒 (TaKaRa)制备cDNA。RT-qPCR在SYBR Premix Ex Taq I I (TaKaRa)反应体系及Bio-Rad CFX96 real-time PCR仪中进行。扩增反应条件为：95 t下30 s, 1次循环;
95 t下变性5 s,60 t下退火31 s,40个循环。成骨相关基 因引物序列见表1，使用GAPDH作为内参；成脂相关基因 序列见表2，使用36S4作为内参。使用LightCycler96软件 (Roche)统计Ct值，以2_4A G i表示基因表达量。
表1hBMSCs成骨分化相关基因引物序列
Table 1Prim er sequences of hBMSCs osteogenic differentiation related genes
Gene Primer sequence (5’-3’）
DLX5F: TTCCAAGCTCCGTTCCAGAC
R: GAATCGGTAGCTGAAGACTCG RUNX2F: TGGTTACTGTCATGGCGGGTA
R: TCTCAGATCGTTGAACCTTGCTA SP7F: CCTCTGCGGGACTCAACAAC
R： AGCCCATTAGTGCTTGTAAAGG COLlAl F: GTGCGATGACGTGATCTGTGA
R: CGGTGGTTTCTTGGTCGGT
BGLAP F: CACTCCTCGCCCTATTGGC
R: CCCTCCTGCTTGGACACAAAG SPP\F: GCCGCTGTAACCTCTTCGG
R: GTCTTCGGCCAATCTGGCTTT GAPDH F: ACTGAGGACCAGGTTGTC
R: TGCTGTAGCCGTATTCATTG
DLX5:Distal-less hom eobox 5; RUNX2:RUNX family transcription factor 2; SP7:Sp7 transcription factor; COL\A\:Collagen type I alpha 1; BGLAP：Bone g am m a-carb o x y g lu tam ate pro tein; SPP\:Secreted phosphoprotein 1; GAPDH:Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
1.6 RNA测序（RNA-seq >检验r77«)C2敲降在转录组水平的变化
为了进一步探究VTHDC2影响hBMSCs成骨分化的 机制，我们采用r r a i>C2敲降的细胞进行了RNA-seq，以检验YrHDC2敲降在转录组水平的变化。siRNA转染48 h 后，使用TRIzol试剂提取总RNA,si-CTRL与si-rTHDC2各 3个生物学重复。使用Illumina TrueSeq mRNA sample
表2 hBMSCs成脂分化相关基因引物序列
Table 2 Prim er sequences of hBMSCs adipogenic differentiation related genes
Gene Primer sequence (5’-3’）
CEBPa F: TTCACATTGCACAAGGCACT
R: GAGGGACCGGAGTTATGACA
PLINl F: TGTGCAATGCCTATGAGAAGG
R: AGGGCGGGGATCTTTTCCT
LPL F: CCCTCTCTTACAAGCCCATCA
R: GAGCCAGTCTGGTAGTACATCA
36B4F: TGAGATTCGGGATATGCTGTTGG
R: CGGGTCCTAGACCAGTGTTCT
CEBPa:CCAAT enhancer binding protein alpha; PLINl:Perilipin 1; LPL: Lipoprotein lipase; 36B4： Ribosomal protein lateral stalk subunit P0.
广州地铁二号线preparation kit制备样本，并在Illumina HiSeq3000 machine 上进行测序。使用STAR_2.6.0a将其映射到人类基因组 (UCSChgl9)并使用DESeq2软件（1.16.1)进行两个比较组 合之间的差异性表达分析，adjusted P value(padj)小于 0.05和log2fold change绝对值大于0.5的基因为差异基因。绘制基因差异性表达分析结果图（火山图MMetascape 网站在线工具）。GO分析通过clusterProfiler(3.4.4)软件 进行，利用GO数据库实现差异表达基因的功能富集分 析。KEGG分析使用clusterProfiler(3.4.4)软件进行，利用 KEGG数据库实现差异表达基因的通路富集分析。
1.7统计学方法
所有数据均以表示。通过非配对双侧f检验进 行统计效能检验，PcO.O S为差异有统计学意义。
2结果
2.1 1T H D C2敲降后成骨分化能力增强
经RT-qPCR验证，si-YTHDC2转染hBMSCs的敲降效 率为62%，满足后续实验要求。ALP染结果显示，成骨 诱导第7天，YTHDC2敲降造成hBMSCs的ALP活性显著升 高，早期成骨分化活性增强（图1A)。茜素红染结果显 示，成骨诱导14 d后，yrHDC2敲降导致hBMSCs形成钙结 节的能力增强（图1B)。成骨诱导第3、5、7天,RT-qPCR 结果显示：s i-yTH DCS组的DLX5、只{7尺义2、SP7、c o l ia i、bglap、s p p i表达均升高(图2)。证明y：rm x：2敲降后hBMSCs成骨分化能力显著增强。
2.2 1T//DC2敲降后成脂分化诱导能力减弱
成脂诱导28 d后，尼罗红染显示，在同一细胞密度 下,si-yTHDC2组形成的脂滴数量和体积都更小(图3)。RT-qPCR结果显示，成脂诱导第3、5、7天，VTHDC 2敲降
第3期文俊儒等:m 6A 结合蛋白Y T H D C 2对人骨髓间充质干细胞分化的影响405
^ si-CTRL group
本丰伞
■■ si-YTHDC2 group
苯丙氨酸解氨酶
图1 siRNA 转染后，hBMSCs 的碱性磷酸酶染及茜素红染结果
Fig 1 hBMSCs alkaline phosphatase staining and alizarin red staining results after siRNA transfection
A: Alkaline phosphatase staining; B: Alizarin red staining. «=3. ***P<0.001, vs. si-CTRL group at the same time point.
si-CTRL group
W K M s\-Y T H D C 2 group
图2 siRNA 转染后，hBMSCs 成骨诱导3、5、7d ，成骨分化相关基因表达趋势
Fig 2 After siRNA transfection, the expression of osteogenic differentiation related genes at day 3, 5 and 7 of osteogenesis induction
«=3. *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001, vs. si-CTRL group at the same time piont.
组成脂相关基PUN 1、LPL 的表达总体呈现下 降趋势（图4)，证明yrHDC 2敲降后成脂分化能力显著减弱。
2.3
Y 77/DC 2敲降后基因转录组的改变
si -r m D C 2及si -CTRL 转染后的RNA -seq 的结果如
下。基因差异性表达分析结果（图5A )显示，7THDC 2 敲降后，162个基因表达上调，230个基因表达下调。GO 功能富集分析发现，与iTHDC 2相关的生物学功能中，相 关性最强的为核糖体，其次为甲型流感、麻疹、单纯疱疹
si-CTRL group si- Y T H D C 2 group
图3 siRNA 转染后hBMSCs 尼罗红染结果（标尺25 nm )
Fig 3 Nile red staining results of hBMSCs after siRNA transfection (scale
bar 25 um)
si-CTRL group si-YTHDC2 group
si-CTRL group si-YTHDC2 group
o o o o o o
5 4 3 2 1 (.s ^O J d &o /D )/^n >p C T J c u l v
v §
s
l O H c f s
J 0u
.2ss3Jdx3
3.>:1E P (^JO U
.2
ss3jdx3 3APBI3
c t i /d
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J O J S S 3J <i x 3 3APB2
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张希骞
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.2s s 3J d x (L >3>1d p c l
i
406
四川大学学报(医学版)
李俊虎
第52卷
0.05
0.10 0.15Gene ratio
图5 siRNA 转染后RNA-seq 结果
陈垣全集Fig 5 RNA-seq results after siRNA transfection
A: Valcano plot ； B: GO analysis results; C: KEGG analysis results, padj: Adjusted P value.
|
Single-stranded RNA binding
Translation factor activity,RNA binding Peptide transmembrane transporter activity
Peptide antigen binding
5SrRNA binding
Translation elongation factor activity
Double-stranded RNA binding
mRNA’s-UTR binding
rRNA binding
Structural constituent of ribosome
Polysome
Small ribosome subunit
Polysomal ribosome
Cytosolic small ribosomal subunit
Large ribosomal subunit
Cytosolic large ribosomal subunit
i Cytosolic part J Ribosome
Ribosomal subunit Cytosolic ribosome
Protein targeting to membrane
Translational initiation Viral gene expression Viral transcription
Nuclear-transcribed mRNA catabolic process Protein localization to endoplasmic reticulum
Establishment of protein localization
Protein targeting to ER
Cotranslational protein targeting to membrane SRP-dependent cotranslational protein targeting
Count
參20
• 40• 60
padj
11.00
0.75 0.50 0.25
病毒感染，NOD 样受体fe 号通路(图5B )。KEGG 通路富 集分析显示，7条通路与mRNA 翻译相关，其中包括：核糖
si-CTRL group
^5
a.
1.5
1.0
0.5
体组成结构、核糖体功能、核糖体亚基、翻译起始、病毒 基因表达、病毒转录和核转录mRNA 的分解(图5C )。
H s i-Y T H D C 2 group
1.5
<
1.0
S
a! 0.5
t/d
图4 siRNA 转染后hBMSCs 第3、5、7d ，成脂分化相关基因表达趋势
Fig 4 After siRNA transfection, the expression of hBMSCs adipogenic differentiation-related genes at day 3,5 and 7 of adipogenesis induction
n=3. *P <0.05, **P<0.01, ***P<0.001, vs. si-CTRL group at the same time piont.
NF-k B p
Huntington disease Afican trypanosomiasis Dilated cardiomyopathy
ECM-receptor
Ferroptosis Necroptosis
Hypertrophic cardiomyopathy
Oxidative phosphorylation
Epstein-Barr virus Pyrimidine metabolism
RIG-I-like receptor Parkinson disease
Hepatitis C
Cardiac muscle contraction
NOD-like receptor Herpes simplex
Measles Influenza A Ribosome
O
log 2 fold change
O
0.3
•••••
•
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