作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(2): 249-255/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@chinajournal
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00249
小麦白粉病菌诱导的TaWRKY34基因的鉴定与分析 秦伟1,2赵光耀2曲志才1,*张立超2段佳磊2李爱丽2贾继增2
孔秀英2,*
1曲阜师范大学生命科学学院, 山东曲阜273165; 2中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部作物种质资源利用重点开放实验室, 北京100081
摘要: WRKY转录因子在植物抗病防卫反应中发挥重要作用。利用cDNA宏阵列(macroarray)和RT-PCR相结合的 方法, 从小麦全长cDNA文库的WRKY转录因子中筛选出一个应答小麦白粉病菌胁迫的TaWRKY34转录因子, 该基
因编码464个氨基酸。染体定位分析表明, 该转录因子位于小麦第一同源染体的短臂上, 并且只在细胞核中表达。其蛋白序列与拟南芥、大麦和葡萄抗病相关WRKY转录因子的亲缘关系较近, 与其中的3个WRKY基因具有 相似的表达模式。TaWRKY34在Pm16/北京8377抗白粉病近等基因系中, 对小麦白粉病菌、水杨酸和茉莉酸诱导的
表达模式存在差异。TaWRKY34可能与小麦对白粉菌的抗性有关。
关键词：小麦; 白粉病菌; WRKY转录因子; 染体定位; 表达模式
Identification and Analysis of TaWRKY34 Gene Induced by Wheat Powdery Mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici)
QIN Wei1,2, ZHAO Guang-Yao2, QU Zhi-Cai1,*, ZHANG Li-Chao2, DUAN Jia-Lei2, LI Ai-Li2, JIA Ji-Zeng2, and KONG Xiu-Ying2,*
1 College of Life Science, Qufu Normal University, Qufu 273165, China;
2 Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Crop Germpl
asm Resources and Utilization, Ministry of Agriculture / Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sci-ences, Beijing 100081, China
Abstract: WRKY transcription factors play important roles in plant defense signaling network. However, little is known about the biological roles of WRKY proteins in wheat (Triticum aestivum L.). The objectives of this study were to screen WRKY transcrip-tion factor genes conferring resistance to powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici, Bgt) and disclose their function in wheat defense reaction. A WRKY transcription factor gene, TaWRKY34, was identified in response to Bgt by cDNA macroarray and semiquantitative RT-PCR from the wheat full-length cDNA libraries that were constructed in the authors' earlier studies. This gene encodes 464 amino acid residues. TaWRKY34 was mapped onto short arms of chromosome 1B and 1D through blast search GrainGenes database and homemade full length cDNA library database of Aegilops tauschii. A further experiment indicated that TaWRKY34 also exists on chromosome 1AS through amplifying in Langdon D-genome disomic substitution lines and Chinese Spring nulli-tetrasomic lines with gene specific primers. Examining the subcellular localization of TaWARKY34, its coding region was fused to the 3′ end of green fluorescent protein (GFP). The GFP signal was detected only in the nucleus of onion epidermal cells to transiently express TaWRKY34-GFP, and the control-GFP protein distributed ubiquitously in both
nuclei and cytoplasm. This suggests that TaWRKY34 is a nucleus-localized protein. Multiple sequence alignments of 57 WRKY domains from various species indicated that TaWRKY34 is closely related to WRKY transcription factors in response to pathogens in Arabidopsis thaliana (AtWRKY3, AtWRKY4, and AtWRKY33), Hordeum vulgare (HvWRKY42 and HvWRKY46), and Vitis vinifera (VvWRKY2) with identities ranging from 81.8% to 94.5%. Furthermore, TaWRKY34 has similar expression pattern with three sequences from A. thaliana, which was up-regulated at first and then down-regulated when inoculated with pathogens. The ex-pression profiles of TaWRKY34 induced by powdery mildew fungus, salicylic acid, and jasmonic acid were different between Pm16/Beijing 8377 near-isogenic lines (resistant to Bgt) and Beijing 837 (susceptible to Bgt). The results imply that TaWRKY34 is probably related to the resistance to powdery mildew in wheat.
Keywords: Wheat; Blumeria graminis f. sp. tritici; WRKY transcription factor; Chromosome location; Expression pattern
本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10A104)资助。
*通讯作者(Corresponding authors)：曲志才, E-mail:zcqu@mail.qfnu.edu; 孔秀英, E-mail: xykong@mail.caas
第一作者: E-mail: dawei-2009@163
Received(收稿日期): 2009-05-06; Accepted(接受日期）: 2009-07-11.
250作物学报第36卷
WRKY转录因子是近年来在植物中发现的一类锌指型转录因子基因家族, 因在其序列的N端含有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列而得名。WRKY 转录因子能够与C/TTGACC/T序列(W-box)发生特异性结合, 从而调节基因的表达[1-2]。研究表明, 在拟南芥中约有68%(49/72)的WRKY转录因子参与抗病防卫反应, 它们中既有正调控因子, 也有负调控因子, 形成一个复杂的抗病调控网络[3-4]; 在水稻中, OsWRKY3、OsWRKY4、OsWRKY7、OsWRKY13、OsWRKY31、OsWRKY45、OsWRKY71和OsWRKY89分别参与了白叶枯和稻瘟病等的抗病防卫反应[5-12]; 在大麦中, 有10个WRKY转录因子基因在受到白粉菌诱导后发生表达量的变化, 其中HvWRKY1和HvWRKY2调控大麦对白粉菌的抗病反应[13-14]。由此可见, WRKY转录因子在植物对病原菌的抗病防卫反应中具有重要的作用。
小麦白粉病是危害小麦生产的主要病害之一。虽然人们已对小麦白粉病菌(Blumeria graminis f. sp. tritici, Bgt)的侵染过程及抗病机制进行了一些研究[15-17], 但目前尚未见小麦WRKY转录因子与小麦白粉病菌相互作用关系的报道。本研究对本实验室小麦全长cDNA文库中的WRKY转录因子基因进行小麦白粉病菌侵染条件下的表达分析, 筛选可能参与小麦抗白粉病反应的WRKY转录因子基因, 以期为深
入研究WRKY转录因子在小麦抗病防卫反应中的作用奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
本实验室在前期试验中, 以感白粉病品种北京837为轮回亲本培育了抗白粉病近等基因系Pm16/北京8377。本试验中, 将北京837和Pm16/北京8377播于营养钵中, 在22℃光照培养箱中长至三叶一心期, 用北京地区流行的白粉病菌生理小种E15喷施法接种足量的白粉菌并保湿。于0 h和处理后2、4、12、24、32和48 h取叶片用于生物胁迫实验。
水杨酸和茉莉酸分别介导活体营养型病原菌和死体营养型病原菌抗性的应答途径。为探明TaWRKY34在抗病和感病近等基因系中的表达模式, 将北京837和Pm16/北京8377用MS培养液培养, 在22℃光照培养箱中生长至三叶一心期, 分别用 2 mmol L-1水杨酸(Sigma公司)和100 mmol L-1茉莉酸甲酯(Sigma公司)喷洒小麦幼苗的叶片至形成液滴滴下为止, 于0 h和处理后0.5、2、4、6、12和24 h 取叶片用于非生物胁迫实验。
用于染体定位分析的材料Langdon及其1A 和1B的代换系LDN1D(1A)和LDN1D(1B)由Steven S. XU博士(USDA-ARS, Northern Crop Science Laboratory)提供; 中国春及其缺体-四体材料CSN1AT1B、CSN1BT1A和CSN1DT1A由本室保存。
1.2 cDNA宏阵列膜的制备
从本实验室小麦全长cDNA数据库中搜索得到WRKY转录因子基因序列76条, 将其命名为TaWRKY1至TaWRKY76。然后从全长cDNA文库中挑选相应的cDNA克隆并提取质粒，将质粒浓度调整至约为100 ng μL-1, 保存于384孔板中。利用Q-Pix (GENETIX)将质粒转移到Hybond-N+尼龙膜(Amersham Biosciences公司)上, 每个克隆点4个重复, 形成边长为1.75 mm的正方形, 不同克隆间距离为2.25 mm。以小麦Tubulin基因作为阳性对照, 水作为阴性对照, 与WRKY转录因子的质粒同时点到尼龙膜上。自然风干后, 放在变性液(0.4 mol L-1 NaOH, 1 mol L-1 NaCl)中变性15 min, 再在中和液0.5 mol L-1 Tris-HCl (pH 7.2), 1 mol L-1 NaCl中浸泡15 min, 最后用蒸馏水漂洗3 min。将膜放到滤纸上晾干, 4℃保存备用。
1.3 cDNA宏阵列杂交和扫描
取接种白粉病菌后不同时间段的Pm16/北京8377小麦幼苗叶片提取总RNA, 利用反转录法标记探针。采用20 μL反应体系, 在0.2 mL离心管中加入1 μg总RNA和1 μL Oligo(dT)18 (500 μg mL-1), 再加DEPC-ddH2O至8 μL。将上述混合物混匀, 65℃水浴 5 min, 冰水浴中速冷。然后依次加入 4 μL 5×First-Strand buffer、2 μL DTT (0.1 mol L-1)、1 μL dNTP混合物(含dATP、dTTP和dGTP, 均为10 mmol L-1)、1 μL RNasin (40 U μL-1)、3 μL α-[32P] dCTP (10 μCi μL-1, 北京福瑞生物工程公司), 1 μ
L Supper-Script II Reverse Transcriptase (200 U μL-1, Invitrogen 公司), 用头吹吸混匀, 短暂离心后, 42℃温浴1 h。
深圳a股在上述混合物中加入30 μL 1×TE, 然后加入5 μL NaOH (3 mol L-1)变性5 min, 将点有WRKY转录因子的尼龙膜放到杂交管中, 加入10 mL Church buffer预杂交液[1%BSA, 10 mmol L-1 EDTA (pH 7.0), 0.5 mol L-1 Na2HPO4 buffer (pH 7.2), 7% SDS]和变性鲑精DNA(终浓度为100 μg mL-1)。在杂交炉中65℃预杂交6 h。然后加入变性的探针, 65℃杂交16
第2期秦伟等: 小麦白粉病菌诱导的TaWRKY34基因的鉴定与分析251
h。将杂交后的尼龙膜分别放在2×SSC和0.5%SDS、
1×SSC和0.5%SDS、0.5×SSC和0.5%SDS洗膜液中
65℃各洗涤两次, 每次5 min, 洗完后放入暗盒中覆
盖磷屏曝光2～3 d, 用Molecular Imager FX (Bio-
Rad)扫描磷屏。
1.4 TaWRKY34的表达分析
分别取生物和非生物胁迫的小麦幼苗叶片提取
总RNA。采用SuperScript II反转录酶(Invitrogen公
司)合成cDNA第一链。采用25 μL半定量RT-PCR体
系, 取1 μL cDNA作模板, 所用引物为TaWRKY34F: 5′-GCTGCCGGCGACATCTTCCT-3′, TaWRKY34R: 5′-GTCCCGGGGCTCGTCCTTGGTG-3′, 扩增条件
为94 5 min; 95 30 s, 55 30 s, 72 40 s, 32℃℃℃℃个
循环; 72 5 min
℃。设2次重复。以小麦Tubulin基因
作为内参, 反应程序运行30个循环, 其他条件同上。
1.5 不同物种WRKY转录因子的聚类分析及
TaWRKY34表达模式分析
从NCBI网站(bi.v/)下载文献中已经报道的病原菌胁迫应答的其他物种WRKY转录因子的全长蛋白质序列, 包括来自大麦[13-14]、水稻[5-12]、拟南芥[3-4,18]、辣椒[19]、葡萄[20]、马铃薯[21]、烟草[22]的共57条序列。将上述WRKY 转录因子的氨基酸序列用ClustalX 2.0.9软件进行序列比对[23], 利用Jalview 2.0软件[24]调整比对结果, 各自取包含WRKY保守结构域的大约50个氨基酸的区段再次进行序列比对, 最后利用MEGA 4.0软件[25]进行系统进化树构建; 将与TaWRKY34处于同一个进化分支的WRKY转录因子进行表达模式比较分析。
1.6 TaWRKY34 的染体定位分析
通过搜索GrainGenes (wheat.v/)
中已经定位的EST序列, 对TaWRKY34进行初步的
电子定位; 然后再根据本室小麦全长cDNA序列的
比对分析, 设计TaWRKY34基因组特异的引物W34F: 5′-GAGCAACAACAAGAAGAAGTGGTTC- 3′, W34R: 5′-GTTGTCACCATGCTCCTTCC-3′, 利用Langdon及其1A和1B的代换系、中国春及其缺体-四体材料进行染体定位。PCR扩增条件为94℃5 min; 95 45 s, 61 45 s, 72 1.5 min, 34
℃℃℃个循环;
72 10 min
℃。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增
产物。
1.7 TaWRKY34的亚细胞定位
强壮功
亚细胞定位所用表达载体为pJIT163-PEG, 该
anit载体通过35S启动子驱动目标基因与绿荧光蛋白(GFP)基因融合表达, 实现目标基因的亚细胞定位。设计引物34-GFPF：5′-AAGCTT ATGTCCTCCTCCA CGGG-3′(前6个碱基为Hin d III酶切位点), 34- GFPR：5′-GGATCC GCAGAGGAGCGACTCGAC-3′(前6个碱基为Bam H I酶切位点), 扩增TaWRKY34基因的编码区序列, 经测序验证后, 进行Hin d III和Bam H I的双酶切, 回收产物与同样进行双酶切的pJIT163-PEG载体连接, 并转化大肠杆菌感受态细胞, 挑单克隆进行质粒提取, 经酶切、测序验证后用于后续转化试验。将含有目标基因的融合表达载体和空载体pJIT163-PEG通过基因(Bio-Rad)轰击转化洋葱表皮细胞, 转化后的洋葱表皮细胞避光培养24 h, 用激光共聚焦显微镜观察照相(Leica)。
2结果与分析
桥梁工程检测技术
2.1白粉病菌诱导的小麦WRKY转录因子的鉴定
以白粉病菌侵染后不同时间段的Pm16/北京8377小麦幼苗叶片的总RNA反转录后所得cDNA作探针, 与点有小麦WRKY转录因子的尼龙膜进行杂交(图1), 可以看出TaWRKY34 (B3位置, 该WRKY 转录因子为TaWRKY34)受白粉病菌诱导后表达量显著上调, 在32 h时表达量达到最高。用Quantity one (Bio-Rad)软件进行表达量变化分析, TaWRKY34在32 h相对于0 h表达量上调超过5倍, 其他WRKY 转录因子表达量变化都不如TaWRKY34显著。
半定量RT-PCR结果显示, TaWRKY34在白粉病菌诱导后表达量上调, 在诱导后32 h表达量达到最高, 随后表达量开始下调(图2), 这与cDNA宏列阵杂交结果一致。同时发现TaWRKY34在白粉病近等基因系中本底表达水平存在明显差异, 在抗病系中的本底表达量很低, 而在感病系中则很高; 抗感近等基因系在受到白粉病菌诱导后, TaWRKY34的表达量变化趋势也完全不同, 在抗病系中表现为受诱导后上调表达, 而在感病系中表现为受诱导后表达受到抑制。
2.2水杨酸和茉莉酸诱导的TaWRKY34的表达分析
水杨酸和茉莉酸处理后, TaWRKY34在抗病和感病近等基因系中表现出不同的表达模式(图3)。在Pm16/北京8377(抗病)中TaWRKY34受水杨酸和茉莉酸诱导后表达量变化趋势基本相同, 均表现为先上调, 6 h和4 h后下调, 24 h再上调; 而在北京837(感病)中诱导前后的表达量没有明显变化。
252作物学报第36卷
图1以小麦白粉病菌E15诱导Pm16/北京8377不同时间段的叶片RNA反转录产物为探针的cDNA宏阵列杂交
Fig. 1 cDNA macroarray hybridization with probes prepared from total RNAs isolated from time course leaves of Pm16/Beijing 8377
induced by wheat powdery mildew strain E15
小麦Tubulin基因(N5)作为内对照, 阴性对照为水(P5)。
Wheat Tubulin gene (N5) was used as internal control. Distilled water was used as the negative control (P5).
图2小麦白粉病菌E15诱导的TaWRKY34在小麦抗白粉病近等基因系中的半定量RT-PCR分析
Fig. 2 Expression analysis of TaWRKY34 by semiquantitative RT-PCR in near isogenic lines under wheat powdery mildew
strain E15 infection
2.3 TaWRKY34基因与其他物种抗病相关WRKY转录因子的聚类和表达模式分析
TaWRKY34在本实验室小麦全长cDNA数据库中序列长度为1 579 bp, 其中ORF为1 395 bp, 编码464个氨基酸。其编码产物TaWRKY34与多个拟南芥、水稻、大麦、辣椒、葡萄和烟草中参与病害胁迫的WRKY转录因子序列同源性较高(图4)。与同一进化分树分支的AtWRKY3、AtWRKY4、AtWRKY33、VvWRKY2、HvWRKY42和HvWRKY46保守结构域的同源性分别为81.8%、83.6%、94.5%、83.6%、87.3%和89.1%。根据文献中的芯片杂交和半定量RT-PCR数据[13,26-27], 将TaWRKY34与它
们受病原菌诱导后的表达模式进行比较, 发现TaWRKY34的表达模式与病原菌诱导后的AtWRKY3、AtWRKY4和AtWRKY33表达模式相似, 但与HvWRKY42和HvWRKY46不同(图5)。
2.4 TaWRKY34的染体定位
将TaWRKY34的全长cDNA序列与GrainGenes 上已经定位的7 104条EST序列进行比对分析, 得到一条与TaWRKY34基因序列同源性为96%的EST
图3水杨酸和茉莉酸胁迫下TaWRKY34在小麦抗白粉病近等基因系中的半定量RT-PCR分析
Fig. 3 Expression analysis of TaWRKY34 by semiquantitative RT-PCR in the near isogenic lines under salicylic acid and methyl
磁卡原理
jasmonate stresses
第2期秦伟等: 小麦白粉病菌诱导的TaWRKY34基因的鉴定与分析253
小型计算机
图4 TaWRKY34与其他物种中参与病原菌胁迫应答WRKY转
录因子蛋白序列的聚类分析
Fig. 4 Phylogenetic analysis of TaWRKY34 with WRKY pro-teins involved in pathogen stress from other species
Ta: 小麦; Hv: 大麦; Os: 水稻; At: 拟南芥; Vv: 葡萄; St: 马铃
薯; Ca: 辣椒; Nt: 烟草。
Ta: Triticum aestivum; Hv: Hordeum vulgare; Os: Oryza sativa; At: Arabidopsis thaliana; Vv: Vitis vinifera; St: Solanum tuberosum; Ca: Capsicum frutescens; Nt: Nicotiana tabacum.
序列(登录号为BG607042), 该EST被定位在小麦1B染体的短臂上。进一步对该EST (BG607042)的Southern杂交图进行分析, 发现其中有一条杂交带未被定位, 而且杂交信号的强度是已被定位到1BS染体的那条杂交带的2倍, 这表明1AS和1DS染体上可能存在TaWRKY34的拷贝。通过对本室小麦全长cDNA文库的检索比对, 获得了来自六倍体小麦祖先种Aegilops tauschii (DD)的序列, 说明小麦D基因组中也存在TaWRKY34的拷贝。为了确定TaWRKY34是否在小麦的1A染体上也有拷贝, 利用TaWRKY34基因组特异引物W34F/R, 在Langdon及其1A和1B的代换系、中国春及其缺体-四体材料中进行PCR扩增(图6), TaWRKY34也被定位在小麦1A染体上。综合上述结果, 推断TaWRKY34存在于小麦第一同源染体的短臂上。
2.5 TaWRKY34的亚细胞定位
通过基因轰击, 在洋葱表皮中瞬时表达融合GFP基因的TaWRKY34。结果显示, TaWRKY34和GFP的融合蛋白定位于细胞核中(图7-A), 而空载体对照GFP则分布于整个细胞中(图7-B), 表明TaWRKY34只在细胞核中表达, 这与转录因子的功能是一致的。
3讨论
植物在受到外界伤害以后, 会迅速启动自身的生化防卫系统, 通过水杨酸和茉莉酸等防卫反应信号途径激活植物防卫基因的表达, 使植物表现出对生物和非生物胁迫的抗性反应。水杨酸和茉莉酸分别介导
活体营养型病原菌和死体营养型病原菌两条不同的防卫应答信号途径, 这两条信号途径在多数情况下是相互拮抗的[28-29], 但在有些情况下是协同作用的。Schenk等[30]在拟南芥中发现了大量受水杨酸和茉莉酸诱导协同表达的基因。Peng等[31]发现棉铃虫取食番茄后, 在启动茉莉酸防卫信号途径的同时, 也使水杨酸信号防卫途径的标志基因PR1、BGL2表达上调, 两条信号转导途径表现为协同表达。本研究的TaWRKY34在小麦抗白粉病近等基因系Pm16/北京8377(抗病)中受白粉病菌、水杨酸和茉莉酸诱导后均表现为上调表达，说明TaWRKY34有可能参与了这两种信号转导途径介导的防卫应答反应。Mangelsen等[13]发现, 处于同一个进化分支的WRKY转录因子的表达模式在单子叶和双子叶植物中具有高度的相似性, 预示着它们在功能上具有一定的保守性。拟南芥的AtWRKY3、AtWRKY4、AtWRKY33与TaWRKY34处于同一个进化分支, 且表达模式相似(图4), 这些基因在不同的病原菌抗性应答途径中都起重要作用, 其中, AtWRKY33在活体和死体营养型细菌的抗性应答过程中都起重要的调节作用[27]; AtWRKY3正调控死体营养型病原菌的抗性应答反应; AtWRKY4对活体营养型病原菌起负调控作用, 对死体营养型病原菌具有正调控作用[32]。小麦白粉病菌是活体营养型病原菌, TaWRKY34在小麦白粉菌、水杨酸和茉莉酸的胁迫下的表达模式及其与来自其他物种抗病相关WRKY转录因子的
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