作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2022, 48(9): 2265 2273 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail:***************
本研究由新疆农业大学生物学创新团队项目(ITB202108)资助。
This study was supported by the Innovative Team Foundation of Biology of Xinjiang Agricultural University (ITB202108).
*
通信作者(Corresponding authors): 刘晓东,E-mail:************************；刘超,E-mail:****************
第一作者:E-mail:*****************
Received (收稿日期): 2021-06-23; Accepted (接受日期): 2022-01-05; Published online (网络出版日期): 2022-02-09. URL: knski/kcms/detail/11.1809.S.20220208.1702.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2022.14109
生活与命运
人情练达即文章李名江1 雷建峰2 祖丽皮耶•托合尼亚孜2 代培红1 刘 超1,* 刘晓东1,*
1
新疆农业大学生命科学学院, 新疆乌鲁木齐 830052; 2 新疆农业大学农学院, 新疆乌鲁木齐 830052
摘 要: 棉花是我国重要的经济作物, 而黄萎病(Verticillium wilt)是棉花生产上的主要病害, 严重危害棉花产量和纤维品质。本研究通过转录组数据分析筛选出1个与棉花抗病相关、不依赖Ca 2+的钙调素结合蛋白基因GhIQM1。该基因受黄萎病菌和水杨酸(SA)诱导表达。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术研究其在棉花抗黄萎病中的功能发现, 抑制GhIQM1基因表达增强了植株对黄萎病的抗性, TRV:GhIQM1植株病情指数、维管束褐化程度、体内病原菌积累量都显著低于TRV:00。qRT-PCR 分析表明, 抑制GhIQM1表达的植株接种黄萎病后, 作为参与水杨酸途径中的3个重要基因NPR1、NPR3和PR 5的表达量显著高于对照。以上结果初步表明, GhIQM1基因可能通过抑制SA 途径负调控了棉花的黄萎病抗性。 关键词: 棉花; 黄萎病; GhIQM1; 基因沉默 Cloning and functional verification of GhIQM1 gene of cotton in response to Verticillium wilt
LI Ming-Jiang 1, LEI Jian-Feng 2, ZULIPIYE·Tuoheniyazi 2, DAI Pei-Hong 1, LIU Chao 1,*, and LIU Xiao-Dong 1,*
1
College of Life Sciences, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang, China; 2 College of Agriculture, Xinjiang Agricultural Univer-
sity, Urumqi 830052, Xinjiang, China
Abstract: Cotton is an important economic crop in China, and Verticillium wilt is the main disease in cotton production, which seriously endangers cotton yield and fiber quality. In this project, GhIQM1, encode a Ca 2+-independent calmodulin-binding pro-tein in cotton, was screened out by transcriptome analysis. The gene was up-regulated by Verticillium dahliae and salicylic acid treatment in cotton. The function of GhIQM1 was explored in cotton in response to Verticillium wilt using virus-induced gene silencing (VIGS) technology. The results showed that disease index (DI), the symptoms of Verticillium wilt, the degree of brown-ing of vascular tissue, and the relative fungal biomass pathogen accumulation in vivo in the GhIQM1-silenced plants (TRV:GhIQM1) were significantly lower than those in the TRV:00 cotton plant. The qRT-PCR results revealed that the gene ex-pression level of NPR1, NPR3, and PR5, involved in the salicylic acid pathway, were significantly higher than the control after inoculation of Verticillium dahliae . The above results indicat
e that the GhIQM1 negatively regulates the resistance of cotton to Verticillium wilt through suppressing SA pathway.
Keywords: cotton; Verticillium wilt; GhIQM1; gene silencing
黄萎病(Verticillium wilt)主要是由大丽轮枝菌引起并以菌核形式寄存于土壤中的一种维管束病害[1-2], 严重制约着棉花的产量和品质。目前防治该病害的有效途径是培育和种植抗病品种[3]。因此筛选和鉴定抗病相关基因, 深入研究棉花抗病分子机制, 已
成为棉花抗黄萎病分子育种的必然要求。
研究表明, 水杨酸(salicylic acid, SA)作为一种重要的防御相关激素, 在针对多种病原体的防御反应以及系统获得性抗性(SAR)的建立中起关键作用。研究发现, SA 水平在病原体攻击的组织中显著增加, 可
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以激活PR基因的表达, 完成对各种病原体的抗性[4-6]。茉莉酸(jasmonic acid, JA)在植物对死体营养型病原体感染的防御反应中发挥至关重要的作用[7]。在棉花和其他植物中, 茉莉酸信号与抗黄萎病侵染的早期防御反应相关[8-9]。病原菌侵染后JA水平的增加也进一步证明了其在棉花防御反应中的作用[10-11]。JA 和SA作为植物免疫反应中的2种重要防御信号分子积极调节了棉花对黄萎病菌感染的防御 作用[12-13]。其信号路径相关的标志基因在黄萎病菌的诱导下, 表达量也会发生显著变化[14], 这都证明了JA/SA介导的信号通路与抗黄萎病的过程相关。
钙信号作为最重要的细胞第二信使之一, 参与了各种生物和非生物胁迫以及发育过程的反应[15]。许多研究表明, Ca2+从Ca2+库中流入细胞对植物早期免疫反应是必不可少的[16], Ca2+离子流入阻断后显著抑制了病原体/微生物相关分子模式触发免疫(P/MTI)反应和过敏反应(HR)[17-19]。2019年环核苷酸门控Ca2+离子通道CNGC2和CNGC4的发现明确了Ca2+离子在植物免疫反应中的直接作用[20]。Ca2+离子是借助钙信号受体来发挥其功能。大多数钙受体蛋白含有作为钙结合域的螺旋-环-螺旋折叠(EF-hand)基序。钙受体蛋白在高等植物中被分为4类[21]: 分别是钙调神经磷酸酶B类似蛋白(CBL)、钙依赖性蛋白激酶(CDPK)、钙调素类蛋白(CML)和钙调素(CaM)[22]。
CaM是最重要的Ca2+信号受体之一, 其通过与CaM结合蛋白(CaMBPs)互作来传递信号, 从而调节细胞生理活动[23]。CaMBPs可分为2类: 依赖于钙离子和不依赖于钙离子[15]。而IQ基序是第一个确定的Ca2+不依赖性CaM结合基序。截至目前, 在植物中已经发现含有IQ基序的蛋白质包括钙调素结合转录激活子(CAMTA)蛋白家族、环核苷酸门控通道(CNGC)蛋白家族、肌球蛋白家族、含有IQ67结构域(IQD)的蛋白家族以及含IQ基序(IQ motif con-taining, IQM)的蛋白家族[24]。IQM蛋白家族成员在拟南芥中共有6个(IQM1~IQM6)。研究表明, IQM1在根系生长、调节气孔运动、JA的生物合成和灰霉病防御过程中具有重要作用[25-27]。IQM2参与拟南芥根的发育及开花调控[28-29], IQM3可能通过光周期
途径调控开花时间[30]。IQM4在拟南芥中与IQM1协同参与光和ABA对气孔运动的调控, IQM5参与年龄途径调控植物开花[31-32]。而IQM6基因的突变推迟了突变体远轴面表皮毛的产生[33]。每个IQM家族成员在植物发育和对环境响应中都扮演着不同的角。而IQM1基因在棉花抗黄萎病过程中的功能还未见报道。本研究鉴定了一个受黄萎病菌和SA诱导表达的IQM家族蛋白基因GhIQM1, 通过VIGS 的手段初步验证了该基因在棉花调控黄萎病菌抗性中的作用。
六龄童章宗义
1材料与方法
1.1供试材料
试验所用材料为陆地棉品种‘TM-1’。高致病性落叶型棉花黄萎病菌‘V991’ (Verticillium dahliae strain ‘V991’)、VIGS载体pTRV1、pTRV2及阳性对照TRV:GhCLA1载体均由本实验室保存。植物多糖多酚总RNA提取试剂盒由杭州博日科技有限公司提供。DNA聚合酶和限制性内切酶为纽英伦生物技术(北京)有限公司和赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品。荧光定量试剂盒、反转录试剂盒等由北京全式金生物技术有限公司提供。MES、乙酰丁香酮(AS)和抗生素等试剂均采用索莱宝生物科技有限公司产品。其他化学试剂均由国内生物公司提供。由华大基因股份有限公司完成引物合成以及DNA 测序。
1.2材料处理及取样空间
经硫酸脱绒后挑选籽粒饱满的‘TM-1’种子, 浸泡于10%的次氯酸钠溶液中30 min, 用蒸馏水反复冲洗5次, 浸泡于无菌水中直至露白, 平铺于发芽纸上37℃培养箱中12 h培养出芽, 选取长势一致的种子种于蛭石和黑土(1∶2)的基质中。每个托盘放24个方盒, 每盒种3~4粒种子。室内温度22~26,
℃在光照16 h/黑暗8 h, 光照强度120 μmol m–2 s–1条件下培养, 离营养土表面10 cm左右的高度铺盖透明塑料膜, 相对湿度维持在70%左右, 在培育7 d后摘下透明塑料膜。等棉苗长至子叶完全展开时进行VIGS注射。待棉苗真叶展开时, 分别选取长势一致的根、茎、叶组织为试验材料, 每个样品取3组生物学重复冻存于-80℃冰箱用于组织表达特性分析。挑选生长状况一致的棉苗进行接菌处理, 将保存于-80℃冰箱的黄萎病菌‘V991’在PDA培养基上进行划线, 25℃培养5 d, 然后挑取单菌落到查氏液体培养基中, 25, 200
℃转 min–1, 培养5 d。将培养好的菌液用血球计数板统计孢子数目, 最后将黄萎病菌菌液孢子数悬浮至终浓度2.0×107个 mL–1用4层纱布过滤用于接种处理。将清洗干净的棉苗根部置于
第9期李名江等: 棉花GhIQM1基因克隆及抗黄萎病功能分析 2267
‘V991’孢子悬浮液中, 用察氏培养基作为对照处理, 分别在不同时间点取3个生物学重复的棉株根部组织。收集材料于液氮中速冻保存, 用于接菌后的表达分析。参考Yang等[34]的方法, 制备100 µmol L–1的SA溶液, 待棉花2片真叶完全展开时, 均匀喷洒于棉花叶片上, 并用保鲜膜覆盖保湿。分别于处理后0
、3、6和12 h后各取3株棉苗真叶混合, 并做3组生物学重复, 对照组以喷洒同等体积的无水乙醇处理, 冻存于–80℃备用。
1.3总RNA的提取和cDNA的制备
用液氮将收集的各组织研磨成粉, 利用植物多糖多酚总RNA提取试剂盒提取并纯化(提取步骤参照说明书), 通过电泳检验RNA的完整性, 采用反转录试剂盒合成第1链cDNA (参照说明书), 用于PCR 扩增的模板。
1.4荧光定量PCR
以cDNA为模板, 每个样本至少3组技术重复。利用ABI 7500系统(Applied Biosystems, 美国), 采用北京全式金生物科技有限公司荧光定量试剂盒, 以棉花GhUBQ7作为内参基因, 依据目的基因和内参基因的Ct值, 利用2–ΔCt法计算基因的相对表达量[35]。通过NCBI网站Primer-BLAST在线软件设计GhIQM1检测引物qGhIQM1-F和qGhIQM1-R以及棉花SA/JA 信号通路标志基因检测引物(表1)进行qPCR分析。1.5GhIQM1基因片段克隆及VIGS载体构建
根据转录组数据分析得到与黄萎病相关的棉花GhIQM1基因, 在陆地棉基因组数据库中进行Blastn 比对, 获得对应的基因编号: Gh06G081800 (A组)和Gh06G080600 (D组)。根据该基因的开放阅读框序列
设计特异性引物GhIQM1-F和GhIQM1-R (表1)片段为417 bp。在上下游引物5'端分别引入Eco R I和Kpn I酶切位点, 并以棉花cDNA为模板, 通过PCR扩增得到抑制GhIQM1表达的目的片段并连接到‘B-Zero’克隆载体上, 构建重组载体B-Zero-GhIQM1, 转化‘DH5α’大肠杆菌感受态细胞, 随后菌液PCR检测克隆产物并通过酶切鉴定, 鉴定正确的克隆送公司测序验证。提取测序正确的含目的片段的重组质粒和烟草脆裂病毒pTRV2空载体质粒以Eco R I和Kpn I
表1本研究中使用的引物序列
Table 1 Primer sequences used in this study
引物名称Primer name
引物序列
Primer sequence (5′-3′)
用途
Application
GhIQM1-F GAATTCAGACCCGTTAGTGAGCTTG
片段扩增Gene fragment amplification GhIQM1-R GGTACCCTCAAGATTTACTTCTTTCCC
基因片段扩增Gene fragment amplification qGhIQM1-F ATCAGCCTGGCAACAAATTC 荧光定量Quantitative real time-PCR qGhIQM1-R CAGCTTTGCCGTTTCTCAAA 荧光定量Quantitative real time-PCR ITS-F AAAGTTTTAATGGTTCGCTAAGA
荧光定量Quantitative real time-PCR VE1-R CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA王术君背景>法律人才
荧光定量Quantitative real time-PCR SA-GhNPR1-F CTAGCTTGCGGAGGGATTGATACC 荧光定量Quantitative real time-PCR SA-GhNPR1-R GAGATGGCTGACCTGTCAAACTGC 荧光定量Quantitative real time-PCR SA-GhNPR3-F GCGGAGAGCATTCGGTTACT 荧光定量Quantitative real time-PCR SA-GhNPR3-R GCTCAACATCGTCGGAGTCT 荧光定量Quantitative real time-PCR SA-GhPR5-F TGAGTGCTCCTACACCGTCT 荧光定量Quantitative real time-PCR SA-GhPR5-R CGACCCCAAATACGAGCCAT 荧光定量Quantitative real time-PCR JA-GhPDF1.2-F CTGTGGTAGCGGATGGTGATAAG 荧光定量Quantitative real time-PCR JA-GhPDF1.2-R GTGCAGACGCATTTGCGAAGGAA 荧光定量Quantitative real time-PCR JA-GhAOC-F AATAGAGCATAAACCCGAAATGAAAG
荧光定量Quantitative real time-PCR JA-GhAOC-R CAAAAATGCCAGACCCACCAGTA 荧光定量Qua
ntitative real time-PCR JA-GhAOS-F TGCCACCTGGTCCTTTCATTTC 荧光定量Quantitative real time-PCR JA-GhAOS-R GCGTGTTTGGGCTCGGAAGGGTCG 荧光定量Quantitative real time-PCR GhUBQ7-F GAAGGCATTCCACCTGACCAAC 内参基因Reference gene
GhUBQ7-R CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG 内参基因Reference gene
下画线部分为插入限制性酶切位点碱基序列。
The underlined part is the nucleotide sequence of the insertion restriction enzyme cleavage site.
2268作物学报第48卷
进行双酶切, 回收重组载体上的目的片段和线性化pTRV2质粒, 用T4 DNA连接酶对目的片段与线性质粒进行4℃过夜连接。构建表达载体pTRV2:GhIQM1并转化大肠杆菌感受态经双酶切验证, 吸取10 μL验证正确的重组质粒用冻融法转化‘GV3101’农杆菌感受态细胞, 挑取单克隆做菌落PCR鉴定, 将鉴定正确的菌液继续扩繁并加入浓度为70%的甘油保菌, 保存于-80℃备用。
1.6农杆菌介导的VIGS
注射前3 d, 从-80℃冰箱中取出含有pTRV: GhIQM1、pTRV:GhCLA1、pTRV2 (空载体)以及pTRV1 (
辅助载体)的农杆菌, 在LB固体培养基上(Kan, 50 μg mL–1; Gen, 25 μg mL–1)画线, 于28℃下培养48 h。经菌落PCR验证挑取含阳性克隆的载体在LB液体培养基(Kan, 50 μg mL–1; Gen, 25 μg mL–1)中, 28 180
℃转 min–1培养24 h, 再以1%的比例接种于LB诱导培养基(Kan, 50 μg mL–1; Gen, 25 μg mL–1; MES, 10 mmol L–1和AS, 20 μmol L–1)中, 28 180
℃
转 min–1过夜培养。2000⨯g离心15 min收集菌体细胞, 将菌体重悬于转化液(MgCl2,10 mmol L–1; MES, 10 mmol L–1以及AS, 200 μmol L–1)调整OD600为1.4左右, 28℃避光静置3 h。将含有pTRV1 (辅助载体)的重悬液分别和pTRV:GhIQM1、pTRV:GhCLA1、pTRV2 (空载体)的重悬液等体积混匀注射棉花叶片。选取生长至7 d 左右的幼苗, 使用注射器针头轻微划破子叶背面造成微伤口分别注射含pTRV:GhIQM1、pTRV:GhCLA1、pTRV2 (空载体)的重悬液。将注射后的材料用清水洗净遮光静置24 h后置于培养室中, 保持室温在22~ 26℃。注射2周后分别取沉默植株和对照植株的根和真叶并通过qRT-PCR方法检测目的基因的表达量。
1.7黄萎病抗性鉴定
棉花幼苗经VIGS注射14 d后, 参照上述1.2方法进行接种, 接种2周后观察沉默和对照植株的表型变化。在接种后20 d采用叶片分级法统计幼苗的病情指数[36], 分别选取沉默和对照发病棉株进行剖杆检测观察维管束褐化情况。在接种黄萎病后, 分别在TRV:GhIQM1和TRV:00棉株子叶节间以下1 cm处用无菌的双面刀片切下5 mm左右的茎段, 放入无菌离心管中加入10%次氯酸钠进行表面消毒处理10 min。无菌水振荡漂洗5次, 放置在PDA培养基(cef, 280 mg L–1)上, 25℃培养5 d, 观察记录黄萎病菌的生长情况并及时照相。检测黄萎病菌转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)基因, 以量化黄萎病菌的相对生物量。分别收集接菌后20 d TRV:GhIQM1与TRV:00棉株下胚轴5 cm长的茎段, 利用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA (参照说明书)。以DNA 为模板, ITS-F和VE1-R为黄萎病菌转录间隔序列特异引物(表1), GhUBQ7作为内参基因, 进行荧光定量PCR, 检测样品植株中黄萎病菌的相对生物含量。2结果与分析
2.1GhIQM1基因表达特性分析
分析GhIQM1在棉花‘TM-1’的根、茎以及叶组织中的表达量发现, GhIQM1在棉花各组织中均有表达, 且在根中相对表达量极显著高于茎和叶(P<0.001), 大约是茎的10倍和叶的20倍(图1-A)。说明在棉花‘TM-1’材料中GhIQM1基因在根中优势表达。
以陆地棉‘TM-1’根部组织为材料, 分析了GhIQM1受黄萎病菌侵染后的表达模式。结果显示, 在接种黄
萎病菌8 h后基因表达量和对照组相比无明显差异, 在接种黄萎病菌12 h后GhIQM1表达量显著上调(与同时间对照处理相比)是对照组的3倍(P<0.01), 这与转录组数据(上调5倍)基本一致。而在接种24 h和48 h后基因的表达水平与对照相比无显著变化(图1-B)。表明GhIQM1基因在处理12 h左右时会受黄萎病菌瞬时诱导表达。
植物在响应各种逆境的进程中激素发挥了至关重要的调节作用。目前已知, SA介导的信号路径参与到植物免疫反应中。为探究GhIQM1基因是否响应SA介导的抗病信号通路, 分析了SA诱导后棉花中GhIQM1基因的表达变化。结果表明, 棉花经SA处理后, GhIQM1基因与对照处理相比在3、6、12 h表达量均显著上升(P<0.01), 暗示GhIQM1受到了SA信号路径的调控(图1-C)。
2.2GhIQM1基因VIGS载体的构建及沉默效率检验
通过PCR获得了用于GhIQM1基因沉默的特异性片段。电泳检测结果表明, 目的片段与预期大小一致。将克隆产物送测序, 测序结果为417 bp与目的片段序列完全一致。构建完成的VIGS沉默载体pTRV2-GhIQM1用Eco R I和Kpn I双酶切验证, 结果与预测一致(图2-A), 证明pTRV2-GhIQM1基因沉默载体构建成功。以pTRV:GhCLA1作为阳性对照, pTRV2空载体作为阴性对照, 评估VIGS的有效性。侵染14 d后, 在VIGS靶向GhCLA1基因的棉株上观察到了白叶片的表型(图2-B)。表明本次试验中VIGS
第9期
李名江等: 棉花GhIQM1基因克隆及抗黄萎病功能分析 2269
图1 GhIQM1基因的表达分析
Fig. 1 Relative expression pattern of GhIQM1 genes
CK: 对照组; V991: 大丽轮枝菌处理组; SA: 水杨酸处理组。**和***分别表示在0.01、0.001水平显著差异。每组样品取3个生物学重复。 CK: control; V991: Verticillium dahliae treatment; SA: salicylic acid treatment. ** and *** mean significant difference at the 0.01 and 0.001
probability levels, respectively. Three biological replicates are for each set of samples.
图2 GhIQM1基因的VIGS 载体构建及沉默效率检验
Fig. 2 Construction of VIGS vector of GhIQM1 gene and its silencing efficiency test
A: M: Trans2K Plus II DNA marker; a: GhIQM1片段的PCR 产物扩增; b: pTRV2-GhIQM1载体的酶切验证。B: 沉默GhCLA1基因表型; C: GhCLA1和GhIQM1基因沉默效率检测。*、**分别表示在0.05和0.01水平显著差异。
A: M: Trans2K Plus II DNA marker; a: PCR product amplification of GhIQM1 fragment; b: restriction digestion verification of pTRV2-GhIQM1 vector. B: silent GhCLA1 gene phenotype; C: GhCLA1 and
GhIQM1 gene silencing efficiency detection. * and ** indicate significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.
系统在陆地棉中能正常工作。qRT-PCR 检测结果表明GhCLA1和GhIQM1基因的表达量与对照相比明显降低, 表明基因在棉花体内沉默效果显著(图2-C)。
2.3 抑制GhIQM1表达后增强了棉花对黄萎病的抗性
在抑制GhIQM1基因表达后, 接种黄萎病菌
‘V991’进行抗病性鉴定。接种20 d 后TRV:GhIQM1叶片坏死、花斑以及黄化等黄萎病表型显著轻于TRV:00棉株(图3-A)。相应棉株的病情指数的统计结果显示, TRV:GhIQM1植株的病情指数显著低于TRV:00植株(图3-B)。剖杆结果显示, 沉默GhIQM1基因的植株维管束褐化程度明显低于对照植株
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