人类TIM-4-EGFP融合蛋白重组体的构建、表达和特性分析 陈治中;胡丽华;卿吉琳
【摘 要】3rObjective The present study aimed to explore the expression and purification of a fusion protein of human TIM-4 and EGFP in li)and evaluate its bioactivity.Methods The cDNA fragments of human TIM-4 and EG-FP genes were respectively amplified by RT-PCR and cloned into prokaryotic expression vector pET-28a. The constructed re-combinant plasmid pET-28a-TIM-4-EGFP was transformed to E. coli BL21 (DE3)for the expression under the induction of IPTG.The expressed protein was purified by Ni-NTA resin.Recombinant protein was analyzed by SDS-PAGE and Western blotting ,and its binding activity to the apoptotic cells was detected under the fluorescence microscope.Results The TIM-4-EG-FP vector was constructed and expressed in E. coli. The TIM-4-EGFP fusion protein was identified and verified by SDS-PAGE and Western blotting.Our results demonstrated that all the TIM-4-EGFP fusion proteins recognize and bind directly to apoptot-ic cells ,but not to viable cells.We further verified that the interaction
s of TIM-4-EGFP with apoptotic cells were blocked by TIM-4-Ig fusion proteins.Conclusion We successfully constructed a fusion protein encoding human TIM-4 and EGFP ,and ex-pressed it li. The fusion protein shows a readily obtainable source of biologically active TIM-4 ,which has considerable potential for further studies on human TIM-4 and its receptor.%目的 构建TIM-4-EGFP融合蛋白的原核表达载体,并评价表达的 TIM-4-EGFP蛋白生物学活性.方法采用RT-PCR方法分别扩增TIM-4和EGFP的cDNA片段,将其克隆至pET28a重组质粒中.重组载体转化大肠埃希菌BL21(DE3) ,用IPTG诱导重组蛋白表达,经镍金属螯合层析柱纯化.通过SDS-PAGE蛋白电泳和Western blot鉴定重组蛋白.并通过荧光显微镜观察评价其生物活性.结果 成功构建TIM-4-EGFP的原核表达载体并在大肠埃希菌中表达,TIM-4-EGFP融合蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳和Western blot鉴定证实. TIM-4-EGFP融合蛋白可以直接识别和结合凋亡细胞,而与活细胞不能结合.同时证实TIM-4-EGFP融合蛋白与凋亡细胞的相互作用可以被TIM-4-Ig融合蛋白阻断.结论 成功构建TIM-4-EGFP表达载体并在大肠埃希菌中表达融合蛋白,表达的融合蛋白具有生物活性,可为将来TIM-4及其受体的研究提供可靠生物来源. 【期刊名称】《华中科技大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2018(047)003
【总页数】7页(P262-268)
【关键词】T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白-4;大肠埃希菌;绿荧光蛋白;细胞凋亡
【作 者】陈治中;胡丽华;卿吉琳
【作者单位】乙腈广西壮族自治区人民医院检验科,南宁 530021;华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科,武汉 430022;广西壮族自治区人民医院生殖医学中心,南宁 530021
【正文语种】中 文
【中图分类】R349.6
T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白-4(T-cell immunoglobulin mucin-4，TIM-4)是TIM蛋白家族成员之一，在免疫调控和免疫耐受等方面起重要作用[1-2]。TIM-4蛋白属于Ⅰ型膜蛋白，虽然具有其他成员类似结构，但是其表达和在机体功能等方面与其他成员有所差异。TIM-1和TIM-3主要表达于T细胞表面，调节T细胞的凋亡和免疫耐受[3-5]。而TIM-4主要表达于抗原
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提呈细胞上，是TIM-1的配体，两者相互作用，提供共刺激分子信号，也是磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)的一个受体；参与调节T细胞的分化与活化及体内细胞凋亡的调控，可能在自身免疫性疾病、过敏性疾病、肿瘤、缺血性脑卒中和艾滋病等多种疾病中起重要作用[5-10]。
膜蛋白占大多数蛋白组中的20%～30%，这些蛋白质在大多数生物化学途径和疾病中起关键作用，所有已知药物靶标至少有50%是膜蛋白[11]。然而，由于其本身含量低，膜蛋白通常难以分离足够量的天然蛋白质用于结构和功能研究[12]。因此，大多数膜蛋白必须通过过表达来获得足够的量用于研究。最近研究表明，绿荧光蛋白(GFP)与目标膜蛋白融合在大肠埃希菌中进行原核表达，如果在大肠埃希菌中进行融合表达的膜蛋白能够在显微镜下观察到荧光，说明膜蛋白以可溶性形式表达，形成了正确蛋白构象；否则是以包涵体方式表达，没有形成正确蛋白构象，需要蛋白质复性；这样，通过监测GFP即可鉴定表达正确构象的膜蛋白[13-14]。增强绿荧光蛋白(EGFP)是GFP的一个突变体，其荧光强度是GFP的35倍[15]。为了更好阐明TIM-4基因在免疫调控和细胞凋亡中的作用，在本研究中，我们通过C末端融合EGFP，构建pET28a-TIM-4-EGFP载体，在大肠埃希菌中表达真核膜蛋白TIM-4，并且初步评价其生物活性。
1 材料与方法
1.1 构建TIM-4-EGFP融合蛋白表达载体
依据Trizol试剂(Invitrogen公司)说明书从人外周血单个核细胞中提取总mRNA。按照逆转录试剂(TaKaRa公司)说明书构建人TIM-4基因家族的cDNA文库。为了构建人TIM-4的表达质粒，采用RT-PCR技术制备人TIM-4(除了终止密码子)的cDNA片段。采用引物，上游：5′-CATGCCATGGATATGTCCAAAGAACCTCTCATTCTC-3′，下游：5′-GCGAGCTCGAGGGTAAAAAGGCCGTCT-3′；上下游引物分别含有限制性内切酶位点(NcoⅠ、SacⅠ)。TIM-4 cDNA片段插入pET28-a(Novagen)NcoⅠ和SacⅠ位置。构建的质粒命名为pET28a-TIM-4，并以传统PCR和测序证实完整性和准确性。EGFP序列以空载体pEGFP-C2为模板扩增，所采用的引物序列，上游：5′-GCGAGCTCATGGTGAGCAAGGGCG-3′，下游：5′-CCGCTC-GAGCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′，上游、下游引物分别含有限制性内切酶位点(SacⅠ、XhoⅠ)。扩增的EGFP片段连接pMD18-T简单载体(TaKaRa公司)，并将EGFP基因PCR阳性的克隆送测序证实其准确性。将测序正确的T载体中EGFP片段亚克隆至pET28a-
TIM-4载体的SacⅠ和XhoⅠ位置，而产生C-末端带一个EGFP-His6标签；或者亚克隆至pET28a载体的SacⅠ和XhoⅠ位置作为一个对照。构建的质粒分别命名为pET28a-TIM-4-EGFP和pET28a-EGFP，并以传统PCR和酶切鉴定。
1.2 TIM-4-EGFP融合蛋白的表达和纯化
为了表达和纯化TIM-4-EGFP融合蛋白，将重组质粒pET28a-TIM-4-EGFP转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3)。从选择培养基挑一个单克隆，接种到含50 μg/mL卡那霉素的LB培养液中，置37℃摇床中190 r/min振荡孵育过夜。培养物按1∶50比例稀释到选择性培养液中，然后在37 ℃摇床中220 r/min振荡生长直到吸光度值(A600 nm)达到0.6。然后在培养液中加入异丙醇β-硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为1 mmol/L，30 ℃振荡培养18 h。以转速6 000×g，4℃离心15 min收集细胞。去掉液相，用冰冷的PBS重悬洗涤细胞片，离心收集细胞，重复2次。再将收集的细胞片重悬于50 mL冰冷的溶菌缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH7.9，0.5 mmol/L NaCl，10% Glycerol)中，加入终浓度为1 mg/mL溶菌酶，混匀、冰浴放置30 min；然后冰浴超声破菌直到细胞溶解。最后，加入终浓度为0.05%的10% Triton X-100，混匀，冰浴放置15 min。在细胞溶解过程中，加入终浓度为1.0 mmol/L蛋白酶抑
李汉柏制剂PMSF。以转速10 000×g，4℃离心30 min收集上清液。上清液经0.45 μm过滤器过滤。收集液体按照Ni-NTA树脂说明书(BBI，重力法)纯化TIM-4-EGFP融合蛋白。过程简述如下：首先用10 mL结合缓冲液(20 mmol/L Na3PO4，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH 8.0)平衡柱子，接着加入样品，然后用10 mL结合缓冲液洗涤柱子；最后，用4 mL洗脱缓冲液(20 mmol/L Na3PO4，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗脱柱子，用灭菌的EP管收集(1 mL/管)。按照SDS-PAGE制胶试剂盒(碧云天公司，中国)说明书制备浓度为10%分离胶，重组融合蛋白用SDS-PAGE分离，并以考马斯亮蓝R-250染和Western blot分析纯度。采用BCA法(碧云天公司，中国)测定纯化的TIM-4-EGFP融合蛋白浓度。
1.3 荧光显微镜下观察融合蛋白的表达
为了评价TIM-4-EGFP融合蛋白的表达，细菌培养物涂抹在玻璃片上，盖上载玻片并用指甲油封片，最后在荧光显微镜下观察样本荧光情况。
1.4 细胞培养
K562、PANC-1、HepG2和CHO细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中37 ℃、5% CO2温箱中培养。
1.5 过钒酸钠的制备
根据参考文献[16]描述的方法制备浓度为200 mmol/L活性原钒酸钠(pervanadate，PV)，过滤灭菌保存。每个实验所用的30 mmol/L PV按照以下的方法临时配制。按照以下顺序依次于一灭菌的EP管中加入150 μL 200 mmol/L PV、843 μL PBS缓冲液、7 μL 30% H2O2，混匀后避光15 min。过量的H2O2用200 mg/mL的过氧化氢酶5 μL去除，混匀后室温避光5 min。再将30 mmol/L PV加入到欲处理的培养细胞的培养液中，PV终浓度为100 μmol/L。ghtt
1.6 荧光显微镜下观察细胞凋亡
人HepG2、PANC-1、K562和CHO细胞株在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中维持生长。为了诱导培养细胞的凋亡，培养瓶中生长的细胞用或者不用PV(终浓度100 μmol/L)处理12 h，K562细胞处理24 h；或者用H2O2(终浓度200 μmol/L)处理12 h，K562细胞处理24 h。经PV或者H2O2处理后，人K562细胞(2×105细胞)经2000 r/min离心5 min。用含2%
老赵与董媛媛在厨房胎牛血清的500 μL RPMI 1640培养液重新悬浮细胞。人HepG2、PANC-1和CHO细胞(2×105细胞)用不含EDTA的胰酶消化。细胞消化后，将它们保存在含血清的培养液中避免过度消化。并经2000 r/min离心5 min，用含2%胎牛血清的500 μL RPMI 1640培养液重新悬浮细胞。然后，人HepG2、PANC-1和K562细胞分别加入6 μL纯化的TIM-4-EGFP，混匀后避光15 min。经过TIM-4-EGFP融合蛋白的孵育，再经1500 r/min离心5 min，用含2%胎牛血清的500 μL RPMI 1640培养液重新悬浮细胞。最后用荧光显微镜检测。同时，按照商品化试剂盒Annexin V(江苏凯基生物技术股份有限公司)的说明书检测凋亡作为平行对照。
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