(19)国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210294661.4
(22)申请日 2022.03.23
(71)申请人 武汉翌圣生物科技有限公司
长安镭蒙
地址 430206 湖北省武汉市东湖新技术开
发区高新大道858号武汉光谷生物医
药产业园一期A5-1栋一至三层
(72)发明人 宋东亮 阳瑜红 刘想 焦亮
(74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司
11332
专利代理师 赵颖
(51)Int.Cl.
C12Q 1/48(2006.01)
G01N 21/64(2006.01)
(54)发明名称
测方法
(57)摘要
本发明公开了一种检测T7RNA聚合酶活性的
试剂盒及检测方法。所述试剂盒包括核苷三磷酸
和含有T7启动子的双链DNA。本发明创造性提出
一种检测T7RNA聚合酶活性的试剂盒及检测方
性，检测过程操作简单、周期短且成本低，同时具
备高灵敏度和准确性，对于实现T7RNA聚合酶活
性的高通量、
自动化检测具有重要意义。
权利要求书1页 说明书7页序列表2页 附图2页CN 114574547 A 2022.06.03
C N 114574547
A
1.一种检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA。
2.根据权利要求1所述的检测T7
RNA聚合酶活性的试剂盒，其特征在于，所述核苷三磷酸包括三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、三磷酸胞苷和三磷酸尿苷；
优选地，所述含有T7启动子的双链DNA的核酸序列包括SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列；
优选地，所述试剂盒还包括T7 RNA聚合酶标准品。
3.权利要求1或2所述的检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒在检测T7 RNA聚合酶活性中的应用。
4.一种T7 RNA聚合酶活性的检测方法，其特征在于，所述方法包括：将待测T7 RNA聚合酶与权利要求1或2所述的检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒中的核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA混合，进行转录反应，检测反应产物中焦磷酸的含量，将所述焦磷酸的含量带入由T7 RNA聚合酶标准品建立的标准曲线中，得到所述待测T7 RNA聚合酶的活性。
5.根据权利要求4所述的T7 RNA聚合酶活性的检测方法，其特征在于，所述标准曲线的建立方法包括：
将T7 RNA聚合酶标准品进行梯度稀释，获得梯度酶活性的T7 RNA聚合酶标准品，分别利用所述梯度酶活性的T7 RNA聚合酶标准品与权利要求1或2所述的检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒中的核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA混合，进行转录反应，检测反应产物中焦磷酸的含量，获取每一个酶活性的T7 RNA聚合酶标准品对应的焦磷酸的含量，根据所述焦磷酸的含量与酶活性的对应关系建立所述标准曲线。
6.根据权利要求4或5所述的T7 RNA聚合酶活性的检测方法，其特征在于，所述转录反应的时间为30～60min，温度为30～40℃。
7.根据权利要求4‑6任一项所述的T7 RNA聚合酶活性的检测方法，其特征在于，所述转录反应后还包括终止反应的步骤。
在烈日和暴雨下8.根据权利要求7所述的T7 RNA聚合酶活性的检测方法，其特征在于，所述终止反应的时间为5～15min，温度为60～70℃。通感
9.根据权利要求4‑8任一项所述的T7 RNA聚合酶活性的检测方法，其特征在于，所述焦磷酸的含量的检测方法包括荧光法。
10.根据权利要求4‑9任一项所述的T7 RNA聚合酶活性的检测方法，其特征在于，所述方法包括：
将T7 RNA聚合酶标准品进行梯度稀释，获得梯度酶活性的T7 RNA聚合酶标准品，分别利用所述梯度酶活性的T7 RNA聚合酶标准品与权利要求1或2所述的检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒中的核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA混合，于30～40℃进行转录反应30～60min，并于60～70℃终止反应5～15min，通过荧光法检测反应产物中焦磷酸的含量，获取每一个酶活性的T7RNA聚合酶标准品对应的焦磷酸的含量，根据所述焦磷酸的含量与酶活性的对应关系建立所述标准曲线；
将待测T7 RNA聚合酶与所述核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA混合，于30～40℃进行聚合反应30～60min，并于60～70℃终止反应5～15min，通过荧光法检测反应产物中焦磷酸的含量，将所述焦磷酸的含量带入所述标准曲线中，得到所述待测T7 RNA聚合酶的活性。
权 利 要 求 书1/1页CN 114574547 A
一种检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒及检测方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒及检测方法。
背景技术
[0002]T7 RNA聚合酶是一类依赖于DNA的RNA聚合酶，并对T7噬菌体启动子有高度特异性。T7启动子是一段具有高度保守的20bp序列，该序列带有RNA转录起始位点。T7 RNA聚合酶对启动子的高度特异性不仅是T7噬菌体侵染的关键，对生物学家来说，还具有非常大的潜在应用价值，例如，T7 RNA聚合酶可以将插入到T7启动子后的DNA序列进行转录，产生大量特异的RNA序列，转录生成的RNA在杂交探针、体外翻译模板、包括RNA剪接和聚腺苷化的转录后修饰过程的研究、以及RNA结构、加工和催化研究等方面具有非常大的利用价值。[0003]由于T7 RNA聚合酶应用领域较广泛，因此准确标定T7 RNA聚合酶的活性，保证各个批次间活性的稳定，具有重要的意义。传统的T7 RNA聚合酶活性测定方法通常采用同位素法，同位素法容易产生放射性污染，对检测设备要求高，操作成本高，难以实现高通量。[0004]综上所述，如何开发一种简单、高效的T7 RNA聚合酶的活性检测方法，有助于实现高通量和自动化的活性检测，且具备高灵敏度和准确性，是T7 RNA聚合酶研究领域亟需解决问题之一。
发明内容
[0005]针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒及检测方法，利用待测T7 RNA聚合酶以含有T7启动子的双链DNA为模板进行转录反应，发现在一定范围内T7 RNA聚合酶的活性与反应体系中焦磷酸的量呈正比，因此，可通过检测反应体系中焦磷酸的量检测T7 RNA聚合酶活性，方法简单、成本低，且具备高灵敏度和准确性，有利于广泛推广应用。
[0006]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本发明提供一种检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒，所述试剂盒包括核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA。
[0008]本发明的试剂盒中包括核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA，将其与待测T7 RNA聚合酶混合后控制温度即可进行转录反应，双链DNA转录模板在T7 RNA聚合酶作用下，转录生成大量RNA链，并伴随着大量焦磷酸的产生，本发明发现在一定范围内T7 RNA聚合酶的活性与反应体系中焦磷酸的量呈正比，因此可通过T7 RNA聚合酶标准品建立T7 RNA聚合酶活性和焦磷酸的量的对应关系的标准曲线，进而通过检测待测T7 RNA聚合酶催化转录反应生成焦磷酸的量计算待测T7 RNA聚合酶的活性，检测原理示意图如图1所示。
[0009]优选地，所述核苷三磷酸包括三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、三磷酸胞苷和三磷酸尿苷。
樟属
[0010]根据本发明，能够作为转录模板的含有T7启动子的双链DNA均能应用于本发明的
试剂盒。
[0011]优选地，所述含有T7启动子的双链DNA的长度为200～1500bp，包括但不限于201bp、202bp、203bp、204bp、210bp、220bp、250bp、300bp、400bp、500bp、600bp、800bp、900bp
、1000bp、1200bp、1300bp、1400bp、1450bp、1480bp或1490bp。
[0012]优选地，所述含有T7启动子的双链DNA的核酸序列包括SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列。
[0013]SEQ ID NO.1：
[0014]AGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTC TAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCG GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCGAGCT CCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAA GGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGC。
[0015]SEQ ID NO.2：
[0016]AGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTC TAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGCGATAAAATCATCCATCTGACCGATGATAGT TTTGATACCGATGTGCTGAAAGCAGATGGTGCAATTCTGGTGGATTTTTGGGCCGAATGGAAAGGCCCGGCCAAAA TGATTGCCCCGATTCTGGATGAAATTGCCGATGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAATATTGATCA
GAATCCGGGTACCGCCCCGAAATATGGCATTCGCGGCATTCCGACCCTGCTGCTGTTTCTGGCCAAACTGACCATT CCGGAAGTGGAACTGCCGAATGCCGAACTGCTGGGTAAACGTCGTCTGGAAAAATTTGCAGCAAAAGTTCAGCAGC AGCTGGAAAGTAGCGATCTGGATCAGTATCGCGCACTCGAACAAGTTTCAGTTGAAACCACTCAAGGCCTTGGCCG CCGTGTAACGATTACTATCGCTGCTGACAGCATCGAGACCGCTGTTAAAAGCGAGCTGGTCAACGTTGCGAAAAAA GTACGTATTGACGGCTTCCGCAAGGGCAAAGTGCCAATGAATATCGTTGCTCAGCGTTATGGCGCGTCTGTACGCC AGGACGTTCTGGGTGACCTGATGAGCCGTAACTTCATTGACGCCATCATTAAAGAAAAAATCAATCCGGCTGGCGC ACCGACTTATGTTCCGGGCGAATACAAGCTGGGTGAAGACTTCACTTACTCTGTAGAGTTTGAAGTTTATCCGGAA GTTGAACTGCAAGGTCTGGAAGCGATCGAAGTTGAAAAACCGATCGTTGAAGTGACCGACGCTGACGTTGACGGCA TGCTGGATACTCTGCGTAAACAGCAGGCGACCTGGAAAGAAAAAGACGGCGCTGTTGAAGCAGAAGACCGCGTGAC CATCGACTTCACCGGTTCTGTAGACGGCGAAGAGTTCGAAGGCGGTAAAGCGTCTGA。
[0017]优选地，所述试剂盒还包括T7 RNA聚合酶标准品。
[0018]第二方面，本发明提供第一方面所述的检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒在检测T7 RNA聚合酶活性中的应用。
[0019]第三方面，本发明提供一种T7 RNA聚合酶活性的检测方法，所述方法包括：将待测T7 RNA聚合酶与第一方面所述的检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒中的核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA
混合，进行转录反应，检测反应产物中焦磷酸的含量，将所述焦磷酸的含量带入由T7 RNA聚合酶标准品建立的标准曲线中，得到所述待测T7 RNA聚合酶的活性。[0020]本发明中，利用待测T7 RNA聚合酶以含有T7启动子的双链DNA为模板进行转录反应，可转录生成大量RNA链，并伴随着大量焦磷酸的产生，具有较高的灵敏度，通过检测反应产物中焦磷酸的含量计算酶活性，焦磷酸的含量检测方法简单，成本低，综合上述，本发明T7 RNA聚合酶活性的检测方法简单、便于操作、成本低且具备高灵敏度和准确性。[0021]优选地，所述标准曲线的建立方法包括：
[0022]将T7 RNA聚合酶标准品进行梯度稀释，获得梯度酶活性的T7 RNA聚合酶标准品，分别利用所述梯度酶活性的T7 RNA聚合酶标准品与第一方面所述的检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒中的核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA混合，进行转录反应，检测反应产物中焦磷酸的含量，获取每一个酶活性的T7 RNA聚合酶标准品对应的焦磷酸的含量，根据所述焦磷酸的含量与酶活性的对应关系建立所述标准曲线。
[0023]根据本发明，能够作为转录反应模板的含有T7启动子双链DNA均能应用于本发明的T7 RNA聚合酶活性的检测方法。
[0024]优选地，所述聚合反应的时间为30～60min，包括但不限于31min、32min、33min、34min、35min、36min、38min、40min、41min、42min、43min、44min、45min、46min、48min、50min
、52min、54min、55min、56min或58min，温度为30～40℃，包括但不限于31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃或39℃。
[0025]优选地，所述聚合反应后还包括终止反应。
生态系统理论[0026]优选地，所述终止反应的时间为5～15min，包括但不限于6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min或14min，温度为60～70℃，包括但不限于61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃或69℃。
[0027]根据本发明，能够检测焦磷酸的含量方法均能够应用于本发明的T7 RNA聚合酶活性的检测方法。
[0028]优选地，所述焦磷酸的含量的检测方法包括荧光法。
[0029]优选地，所述荧光法包括使用焦磷酸检测试剂盒进行检测。
[0030]优选地，所采用的荧光定量试剂为PPi Sensor。
[0031]本发明中，焦磷酸可以利用焦磷酸检测试剂盒，通过荧光法测得，并且焦磷酸的相对量以荧光强度表示。
[0032]作为优选的技术方案，所述T7 RNA聚合酶活性的检测方法包括：
[0033]将T7 RNA聚合酶标准品进行梯度稀释，获得梯度酶活性的T7 RNA聚合酶标准品，分别利用所述梯度酶活性的T7 RNA聚合酶标准品与第一方面所述的检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒中的核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA混合，于30～40℃进行转录反应30～60min，并于60～70℃终止反应5～15min，通过荧光法检测反应产物中焦磷酸的含量，获取每一个酶活性的T7 RNA聚合酶标准品对应的焦磷酸的含量，根据所述焦磷酸的含量与酶活性的对应关系建立所述标准曲线；
[0034]将待测T7 RNA聚合酶与所述核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA混合，于30～40℃进行聚合反应30～60min，并于60～70℃终止反应5～15min，通过荧光法检测反应产物中焦磷酸的含量，将所述焦磷酸的含量带入所述标准曲线中，得到所述待测T7 RNA聚合酶的活性。
[0035]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0036](1)本发明的试剂盒中包括核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA，将其与待测T7 RNA聚合酶混合后控制温度即可进行转录反应，本发明发现在一定范围内T7 RNA聚合酶的活性与反应体系中焦磷酸的量呈正比，因此可通过检测待测T7 RNA聚合酶催化转录反应生成焦磷酸的量计算待测T7 RNA聚合酶的活性；
[0037](2)本发明中，利用待测T7 RNA聚合酶以含有T7启动子的双链DNA为模板进行转录郑州大学文学院
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