(19)国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210711368.3
(22)申请日 2022.06.22
(71)申请人 湖南大学
地址 410082 湖南省长沙市岳麓区麓山南
路2号
(72)发明人 谭蔚泓 叶茂 彭天欢 李小东
(74)专利代理机构 长沙市融智专利事务所(普
通合伙) 43114
专利代理师 袁靖
(51)Int.Cl.
C12N 15/115(2010.01)
C12N 15/11(2006.01)
国宝沉浮录
C12N 5/078(2010.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种特异性识别并结合循环
应用；利用核酸适体与外周血中胎儿细胞的特异
性结合实现稀有细胞的分离富集。本发明方法具
有以下显著优势：1)发展了新型胎儿细胞捕获及
无损释放方法，具有重要临床意义；2)基于临床
样本筛选的特异性探针，具有更强的临床适用
性；3)核酸适体在识别过程中对循环胎儿有核红
细胞特异性强、亲和力高，准确性和灵敏度好；4)
核酸适体探针生产制备简单、重复性好，稳定性
好、易存储运输。为产前疾病筛查与诊断提供了
新的方法与途径。
权利要求书2页 说明书9页序列表2页 附图5页CN 115109780 A 2022.09.27
C N 115109780
A
1.一种特异性识别并结合循环胎儿有核红细胞的核酸适体，其特征在于，能特异性识别并结合孕妇外周血中的循环胎儿有核红细胞，所述的核酸适体LXD‑11序列如下：5’‑ATCCAGAGTGACGCAGCAAAGTCGTCTTTGCCAAATACCGGTCTGTCGGTGGGTATTGTGGACACGGTG GCTTAGT‑3’。
2.根据权利要求1所述的特异性识别并结合循环胎儿有核红细胞的核酸适体，其特征在于，通过对所述的核酸适体LXD‑11部分增加或者删减碱基，或者碱基替换获得具有相同功能的核酸适体LXD‑11b序列如下：
5’‑TCCAGAGTGACGCAGCAAAGTCGTCTTTGCCAAATACCGGTCTGTCGGTGGGTATTGTGGACACTCTG GC‑3’。
3.根据权利要求1或2所述的特异性识别并结合循环胎儿有核红细胞的核酸适体，其特征在于，所述的核酸适体标记上荧光物质、放射性物质、性物质、生物素、或酶标记物质，得到与所述核酸适体
具有相同功能的核酸适体衍生物。
4.权利要求1‑3任一项所述的核酸适体在制备特异性识别并结合循环胎儿有核红细胞制剂中的应用。
5.一种基于核酸适体的循环胎儿有核红细胞识别与富集方法，其特征在于，所述核酸适体包括权利要求1‑3任一项所述的核酸适体。
6.一种基于互补核酸序列无损释放循环胎儿有核红细胞的方法，其特征在于，
利用互补释放序列释放被权利要求1‑3任一项所述的核酸适体识别与富集的循环胎儿有核红细胞，针对所述的核酸适体LXD‑11的互补释放序列RA1和/或RA2如下：RA1：5’‑ACTAAGCCACCGTGTCCACAATACCCACCGACAGACCGGTAT‑3’。
RA2：5’‑ACCGGTATTTGGCAAAGACGACTTTGCTGCGTCACTCTGGAT‑3’；
针对所述的核酸适体LXD‑11b的互补释放序列RA3和/或RA4如下：
建筑施工高处作业安全技术规范RA3：5’‑GCCAGAGTGTCCACAATACCCACCGACAGACCGGTATTTGGC‑3’；
RA4：5’‑GACCGGTATTTGGCAAAGACGACTTTGCTGCGTCACTCTGGA‑3’。
7.权利要求6中所述的互补释放序列在制备被权利要求1‑3任一项所述的核酸适体识别与富集的循环胎儿有核红细胞无损释放制剂中的应用。
8.一种无损释放循环胎儿有核红细胞的互补释放序列，其特征在于，所述的互补释放序列RA1和/或RA2如下：
RA1：5’‑ACTAAGCCACCGTGTCCACAATACCCACCGACAGACCGGTAT‑3’；
RA2：5’‑ACCGGTATTTGGCAAAGACGACTTTGCTGCGTCACTCTGGAT‑3’；
卫生防疫站
互补释放序列RA3和/或RA4如下：
RA3：5’‑GCCAGAGTGTCCACAATACCCACCGACAGACCGGTATTTGGC‑3’；
RA4：5’‑GACCGGTATTTGGCAAAGACGACTTTGCTGCGTCACTCTGGA‑3’。
9.一种无损释放循环胎儿有核红细胞的制剂，其特征在于，包括所述的互补释放序列RA1和/或RA2如下：
RA1：5’‑ACTAAGCCACCGTGTCCACAATACCCACCGACAGACCGGTAT‑3’；
集中空调系统
RA2：5’‑ACCGGTATTTGGCAAAGACGACTTTGCTGCGTCACTCTGGAT‑3’；
互补释放序列RA3和/或RA4如下：
RA3：5’‑GCCAGAGTGTCCACAATACCCACCGACAGACCGGTATTTGGC‑3’；
RA4：5’‑GACCGGTATTTGGCAAAGACGACTTTGCTGCGTCACTCTGGA‑3’。
一种特异性识别并结合循环胎儿有核红细胞的核酸适体、互
补序列及它们的应用
技术领域
[0001]本发明属于稀有细胞分离富集技术领域，具体涉及一种识别富集外周血中循环胎儿有核红细胞的核酸适体、无损分离互补释放序列及它们的应用。
背景技术
[0002]循环胎儿有核红细胞是指在妊娠期间经母体‑胎盘物质交换进入母亲血液循环中的胎儿有核红细胞。循环胎儿有核红细胞直接来源于胎儿血液组织且包含胎儿完整的遗传信息，理论上可实现胎儿遗
传性疾病的全基因组分析和诊断；此外，其具有生命周期短，分娩后快速从母体外周血中消失，不受既往妊娠影响等优势，是目前公认最理想的无创产前诊断材料之一。然而，母体外周血中的循环胎儿有核红细胞含量极低，每毫升血液中仅6‑10个胎儿有核红细胞。因此，特异性分离富集母体外周血中循环胎儿有核红细胞是实现全面、准确无创产前诊断的关键技术瓶颈。
[0003]目前，循环胎儿有核红细胞的分离富集方法主要包括两大类：一类是基于有核红细胞物理化学性质的分离方法，包括有密度梯度离心法、微孔过滤法和介电泳分离法，使用这类方法分离富集后的胎儿有核红细胞纯度较低，后续遗传分析过程中受大量母体细胞的干扰；另一类是基于有核红细胞表面特异性抗原的分离方法，包括有免疫磁珠分离法、流式细胞分选等。目前抗体是最常见的用于有核红细胞表面特异性抗原识别分子探针，单克隆抗体分子复杂的生产过程、生产批次间差异、苛刻的保存及运输条件，成为导致其较低富集效率的关键因素，导致基于抗原‑抗体相互作用的有核红细胞捕获技术应用于外周血中微量有核红细胞捕获时，均无法满足临床应用的需求。因此，开发新型分子识别探针是该技术领域突破临床转化技术瓶颈的关键核心。
[0004]核酸适体(Aptamer)是利用指数富集配体系统进化技术(System Evolution of Ligands by Exponential Enrichment；SELEX)从核酸文库中筛选得到的一类能高特异性、高亲和力结合靶标的单链DNA/RNA序列。核酸适体与其靶标分子的识别和结合具有类似抗原‑抗体相互作用的特异性和亲和力，被形象的称为“化学家的抗体”。此外，核酸适体并具有靶标范围广、易于精准制备及修饰标记、
设计灵活可控、制造成本低等突出优点，在化学传感、分子医学等领域具有广泛的应用与独特的优势。
[0005]本发明直接以临床有核红细胞样本为筛选靶标，通过活细胞核酸适体筛选技术开发的核酸适体可特异性识别并高亲和结合有核红细胞，而与外周血中的母体细胞作用较弱。该核酸适体可以作为高效的分子识别探针，特异性识别和标记母体外周血中的循环胎儿有核红细胞，实现稀有循环胎儿有核红细胞的高效捕获，从而实现基于循环胎儿有核红细胞的疾病筛查与诊断。
发明内容
动植物检疫[0006]本发明的首要目的是提供一种高特异性、高亲和力的循环胎儿有核红细胞特异性
核酸适体分子探针。
[0007]本发明的核酸适体获取方式如下：
[0008]1)采用临床新生儿脐带血中有核红细胞作为筛选靶标，有效排除细胞系与临床实际样本间的差异，增强筛选核酸适体探针的临床适用性。
[0009]2)以临床新生儿脐带血中单个核细胞进行竞争筛选(1～2轮)，通过富集复杂样本中特异性结合有核红细胞的序列，提高筛选序列的特异性。
[0010]3)以纯化的有核红细胞作为正筛细胞，以其它血液细胞混合样本作为负筛细胞，完成14轮特异性序列富集与扩增。
[0011]通过高通量测序及生物信息学分析，成功获得有核红细胞特异性核酸适体探针LXD‑11，
[0012]核酸适体探针序列、结构优化及表征，成功获得特异性高、亲和力强、结构稳定的有核红细胞特异性核酸适体探针LXD‑11b。
[0013]本发明的特异性识别并结合循环胎儿有核红细胞的核酸适体，能特异性识别并结合孕妇外周血中的循环胎儿有核红细胞，所述的核酸适体LXD‑11序列如下：
[0014]5’‑ATCCAGAGTGACGCAGCAAAGTCGTCTTTGCCAAATACCGGTCTGTCGGTGGGTATTGTGGACAC GGTGGCTTAGT‑3’，见SEQ ID NO.1。
[0015]进一步地，通过对所述的核酸适体LXD‑11部分增加或者删减碱基，或者碱基替换获得具有相同功能的核酸适体LXD‑11b序列如下：
[0016]5’‑TCCAGAGTGACGCAGCAAAGTCGTCTTTGCCAAATACCGGTCTGTCGGTGGGTATTGTGGACACT CTGGC‑3’，见SEQ ID NO.2。
[0017]更进一步地，所述的核酸适体标记上荧光物质、放射性物质、性物质、生物素、或酶标记物质，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物。
[0018]本发明的第二个目的是提供上述的核酸适体在制备特异性识别并结合循环胎儿有核红细胞制剂中的应用。
[0019]本发明的第三个目的是提供基于上述核酸适体的循环胎儿有核红细胞识别与富集方法。
[0020]本发明的第四个目的是提供基于互补核酸序列无损释放循环胎儿有核红细胞的方法；具体是利用互补释放序列释放被上述的核酸适体识别与富集的循环胎儿有核红细胞，
[0021]针对所述的核酸适体LXD‑11的互补释放序列RA1和/或RA2如下：村长轶事
[0022]RA1：
[0023]5’‑ACTAAGCCACCGTGTCCACAATACCCACCGACAGACCGGTAT‑3’，见SEQ ID NO.3。[0024]RA2：
[0025]5’‑ACCGGTATTTGGCAAAGACGACTTTGCTGCGTCACTCTGGAT‑3’，见SEQ ID NO.4；[0026]针对所述的核酸适体LXD‑11b的互补释放序列RA3和/或RA4如下：
[0027]RA3：
[0028]5’‑GCCAGAGTGTCCACAATACCCACCGACAGACCGGTATTTGGC‑3’，见SEQ ID NO.5；[0029]RA4：
[0030]5’‑GACCGGTATTTGGCAAAGACGACTTTGCTGCGTCACTCTGGA‑3’，见SEQ ID NO.6。
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