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利用ITS序列鉴定真菌

摘要：采用蘑菇提取的DNA及琼脂糖凝胶电泳检测，以ITS1和ITS2为引物构成的PCR反应体系对目的DNA片段（ITS1区）进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测后进行分析照相，测序。随着核糖体Rdna ITS序列分析技术在菌物研究中的应用，一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术得到了解决，一些重要的菌物遗传信息的到阐明。

关键词：ITS序列酵母菌 PCR 菌种鉴定

1 材料与方法

1.1材料与试剂：真菌组织（蘑菇）、菌丝体或孢子、氯仿-异戊醇（24：1）：现配现用。

70%乙醇：用95%乙醇配制，现配现用。

10×TAE溶液：1L溶液中含Tris1.2114g，EDTA29.22g，用HCl调pH至8.0。

1%琼脂糖凝胶：取1g琼脂糖溶于100ml1×TAE溶液中，微波炉加热至沸腾三次，CTAB溶液、异丙醇，双蒸水，3MNaAc，PH5.2 20ug/RNaseA，特异性片段PCR扩增，ITS引物（

F:CCGTAGGTGAACCTGCGG,R:TCCTCCGCTTATTGATATGC）。

1.2主要仪器与设备

表一实验中使用的主要仪器

仪器名称	型号	产地
立式自控高压蒸汽灭菌器	ifcLDZX-40SSI	上海申安医疗器械厂
数显	HH-4	国华电器有限公司
电泳仪	DYY-12	北京市六一仪器厂
制冰机	AF200PSC50R	ΜSA
生物安全柜	HFsafe 1200/C	上海力申科学仪器有限公司
电冰箱	BCD-219D	青岛海尔股份有限公司
Sigma高速离心机	3K30	Germany
电子精密天平	HR-200	上海精科天平
酸度计	DELTA302	上海
电子可调电炉	101RF-3	天津市泰斯特仪器有限公司
双层恒温振荡器	THZ-9511K	太仓市实验设备厂
紫外分析仪	WD-9403C 电除尘器标准	北京市六一仪器厂
台式常温高速离心机	Centrifuge 5415D	Germany
恒温水浴锅	多型号	Germany
生化培养箱	LRH-250	上海一恒科技有限公司
基因扩增仪	Palm-Cyeler	Aμstralia
电泳槽	DYCZ-24A	北京六一仪器厂

1.3实验方法：

真菌基因组DNA的提取

（1）CTAB溶液在6麝鼩5℃水浴中预热（使用前加入1％巯基乙醇），取适量

（2）取适量蘑菇置于研钵中，加入液氮，用小杵磨制粉状，研磨期间及时添加液氮防止高温氧化。

（3）液氮中预冷小勺和离心管，取0.1-0.2g的研磨样品放入1.5ml离心管中，加入700ul的CTAB溶液，轻轻搅拌摇匀，置于65℃水浴中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出。

（4）室温冷却2min，加入等体积Tris酚/氯仿/异戊醇溶液，颠倒混匀抽提15-20分钟。

（5）小心吸取上清液约500ml，加入等体积异丙醇颠倒混和（此刻能见到DNA絮状物）

（6）10000rpm，离心10min，倒掉液体，留下沉淀。

（7）加入1ml70％的乙醇洗涤DNA沉淀，10000rpm，离心5min，倒掉液体，干燥DNA（超净台风干或自然风干）

（8）沉淀风干透亮后50ulTE缓冲液，使DNA溶解，置于-20℃保存。

真菌基因组DNA的检测：

⑴制备琼脂糖凝胶：将10×TAE贮存液用蒸馏水稀释成1×TAE电泳缓冲液,待用，按1％称取适量琼脂糖,置于250ml锥形瓶中，加入对应量1×TAE稀释缓冲液，盖上封口膜，以减少水份蒸发，放入微波炉里加热沸腾，取出摇匀，使瓶壁上粘附的琼脂糖全部溶解，反复3次，至琼脂糖全部熔化，放置，待其稍冷却。

⑵胶板的制备：将制胶槽置于水平支持物上,选择合适厚度和齿数的样品梳，插上梳子。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液数滴，摇匀，小心地倒入制胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后，小心拨出梳子，将胶块取出，置于已加入足量1×TAE电泳缓冲液得电泳槽内。

⑶加样：取20μlDNA样品与2μl6×加样缓冲液混匀,用微量移液小心加入样品槽中，在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入5μl的100bpDNA ladder。

⑷电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源，以5V/cm（约100V）电泳，当溴酚蓝染料移动到距

凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。

⑸成像：戴上一次性手套，在波长为254nm的长波长紫外灯下观察胶块，DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红荧光条带，用凝胶成像系统照相。

PCR扩增：

ITS引物（F:CCGTAGGTGAACCTGCGG,R:TCCTCCGCTTATTGATATGC）。

PCR扩增产物的检测，采用琼脂糖凝胶电泳系统检测同上。

ITS片段的测序：

将PCR扩增产物邮寄至测序公司，由测序公司完成测序。

BLAST比对、鉴定属、种：

登录NCBI主页-点击BLAST-点击Nucleotide-nucleotide BLAST在Searc本框中粘贴检测序列-点击BLAST-点击Format-得到result of BLAST。

2 结果与分析

2.1界面张力基因组DNA电泳图

图片不是很清晰，由于在处理过程中没有及时记下顺序，所以对于上图就无法清楚准确的进行分析，这是一个失误。图片中能见到有一条条亮的是“Mark” 共有1200、900、700、500、300、150、100、50bp等8类DNA片段，根据原图对比，本次实验只可以检测到12少先队章程00、900、700、500、300、100bp等6类DNA片段。图片中基因组DNA破损片段较小。

2.2ITS测序结果

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAATGAATTCACTATGGAGTTGTTGCTGGCCTCTAGGGGCAT

GTGCACGCTTCACTAGTCTTTCAACCACCTGTGAACTTTTGATAGATYTGTGAAGTCGTCTTTCAAGTCG

TCAGACTTGGTTTGCTGGGATTTAAACGTCTCGGTGTGACAACGCAGTCTATTTACTTAACACACCCCAA

沈阳1949

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