利用Cas9/ gRNA 体外细胞水平敲除基因的protocol
1.基因靶位点的选择遵循 GGN(17-18)NGG（N 为任意碱基）的序列要求，其中GGN(17-18) 是与靶基因结合的位点， NGG 是 Cas9 蛋白切割所必须的 PAM（protospacer-adjacent motif）区。因为我们实验室所用的 pU6-gRNA 体外转录载体是U6 启动子，所以要求第一位碱基为 G，第二位碱基可任意修改。此外，可在正义链或反义链上选择靶位点。 图1. Cas9的作用原理（引自Mali et al., 2013）
2.对于coding gene，靶位点尽量选择在基因CDS的前2/3区域并且在ATG之后，但是不要在最后一个exon上；最好能破坏重要的domain和/或所有的isoform/variant。同时还要考虑避免在第一个起始密码子的下游还存在额外的具有相同阅读框（in-frame）的起始密码子。靶点也可选择在intron和exon交界处，以破坏基因的剪接。原则上不要选择5’-UTR和3’-UTR。 可参考如下的Cas9靶位点预测网站：/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx
二、Cas9靶位点的确认
1. 确认靶点在基因组中的唯一性：靶位点序列在Ensembl/NCBI网站进行blast，确认是基因组中的单一位点。
2．PCR扩增靶点序列：从准备用于打靶的样品中PCR扩增靶点及附近的序列。在靶位点周围设计引物，使其距离靶位点两侧都大于100 bp，并且PCR扩增产物最好不要超过500
bp，且为单一条带。
3．检测酶切效率：如果计划采用酶切法检测靶点的突变情况，则需要对上述PCR产物进行酶切验证。要求尽量酶切完全，并且电泳后能明显与原条带区分开。
4．测序确认靶点序列：将PCR产物直接送去测序（不需要TA克隆）。如果实测序列跟靶点的预测序列有出入，原则上应根据实测结果设计gRNA序列；但是，如果实测序列不再符合靶点选择的原则（例如，PAM区不是NGG，或5’端不是GG），则应重新选择靶点。 三、构建gRNA-target载体
1. 靶位点退火成含黏性末端的小片段
选择了合适的靶位点之后，根据靶位点合成两条 oligo（均为 24 nt，s 序列猪蹄甲
与靶序列同向，As 反向），如下：
s 引物序列为： CACC硫酸锌片 GN(19)
As 引物序列为：其他与其它的区别AAAC GN(19) 的反向互补的序列
按照下列条件在 1.5ml EP 管中配置反应液后，
用一个烧杯装满水，在微波炉里加热至沸腾后，把配置好的反应液置入大烧杯中，继续中火加热 10min 后，取出大烧杯自然冷却至室温后取出 1.5ml EP 管瞬时离心备用。
2.空载体（pU6-gRNA）的线性化
pU6-gRNA (U6-gRNA_cloning vector (BbsI), 有图谱，3927bp) 质粒含有两个 BbsⅠ酶切位点，其部分序列如下图：
TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGTCTTCGAGAAGACCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTA
方框为U6启动子；
GTCTTC和GAAGAC为两个BbsI酶切位点，切后产生绿标记的粘末端；20bp靶点插入粘末端之中；
酶切体系：
pU6-gRNA plasmid (300ng/ul) | 30ul(≈10ug) | 37泡花碱℃, 4h; 切胶回收， 30ul ddH2O 溶解。 -20℃保存，以后可用。 |
10* Buffer | 5ul |
BbsI(FD) | 5ul |
ddH2O | To 50ul |
| | |
3.L-gRNA 与退火靶位点的连接
L-gRNA 与退火靶位点的连接用 TAKARA 公司提供的 solutionⅠ，在 PCR 管中
配置反应液混匀后，
16℃，30min (时间不宜过长，因为连接片段只有20bp)。然后转化，涂卡那（kanamycin）抗性的平板，第二天后挑取 2-4 个菌落扩大培养提取质粒送测序，测序引物用通用 引物SP6，正向测序。测序正确的 gRNA 质粒备用。
具体步骤如下：10μL 连接产物+50μL Top 10 感受态细胞→混匀后，冰上放置
30min→42℃，90s→冰上冷却约 3min→加入 500μL 无抗性 LB 培养基，37℃摇床中摇晃 30min→取 250μL 涂卡那平板，过夜培养→挑取单个菌落。
制作好的gRNA测序回来后比对：要完全匹配（把靶位点置换GN19）
U6promoter+targetRNA+guideRNAscaffold:
TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC
GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTA李汉俊
四、准备转染细胞所需的CMV-hCas9(真核:pcDNA3.3-hCas9 (addgene41815))
该质粒有图谱，9553bp。
五、转染细胞
1. 细胞系的选择：根据打靶基因及打靶样品，确定所需要的细胞系。例如，如在小鼠中打靶某个基因，则可以选择 3T3细胞系，最好是选择该品系小鼠的ES细胞或是该小鼠品系所建成的细胞系。aln
2. 转染方法：参见Lipofectamine® 2000 DNA Transfection Reagent Protocol
CMV-hCas9直接使用（氨苄抗性）:U6-gRNA-BbsI（卡那抗性） = 3：1转染即可
六、筛选携带靶位点突变的单个克隆细胞
1. 抗性筛选：转染细胞24h后, 换成新鲜培养基，加G418(白粉末，融点138～144℃，溶
于水、甲醇。1g包装的G418瓶子中，加入10ml/(2ml)HEPES溶液，浓度为100/(500) mg/ml完全溶解后，0.22 um过滤，－20度保存。) 筛选。浓度：500-800ug/ml, G418 保存浓度为500ug/ul. 筛选时间约10-14天。
2. 单个克隆：尽量在100mm dish 接种少量细胞, 可接种100-200个细胞。
3.挑取单克隆：单个细胞形成的克隆大约需要2-3周，提取基因组，PCR扩增靶点序列。
4. PCR结果直接测序：根据测序结果的峰图，判断单敲，双敲的效率。
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