3RACE-takara
水泥电阻
TaKaRa Code：D314
3’-Full RACE Core Set Ver.2.0
(20 RT Reactions)
内 容页 码
●制品说明 1
●制品内容 1
●保存 2
●试剂盒特点 3
●RNA样品制备 3
●使用实验样品RNA时的实验操作 6
●实验例 8
●Q&A8
●参考文献 9
●制品说明
本试剂盒是高灵敏度、高特异性扩增cDNA 3′末端全长的试剂盒。对RNA结构进行分析时，一般先通过RT-PCR反应扩增目的区域，然后再对扩增出的目的DNA片段进行克隆、序列分析等。一般的RT-PCR 反应很难得到全长的cDNA片段，然而在基因工程研究中，分 析遗传基因的全长cDNA序列又是十分重要的。RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）法能有效地解决这一问题。TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0能够通过已知的cDNA序列，高灵敏度、高特异性地扩增cDNA的3′末端的全长序列。
本试剂盒中含有完成3′-RACE操作的主要试剂。试剂盒中使用的Reverse Transcriptase M-MLV （RNase H-）经过了本公司的特殊改良，反转录性能良好，无RNase H活性，大大增加了反转录性能。
jingpingmei结合使用TaKaRa LA Taq?（TaKaRa Code：DRR02AM）进行PCR扩增时，其3′RACE的扩增性能大大优于其他同类产品。
本试剂盒应用了套式PCR原理，增加了PCR扩增的特异性与灵敏度，可以对少量样品或低丰度的基因进行3′RACE实验，并且对长片段的3′RACE扩增具有明显优势，我们曾经使用本试剂盒成功扩增了8 kbp 的3′RACE DNA片段。使用TaKaRa LA Taq?扩增得到的PCR产物3′端附有一个“A”碱基，其产物可直接克隆于T-Vector中。反转录引物3′RACE Adaptor Primer含有由TaKaRa独特设计的dT区域，反转录效率高。3′RACE Inner Primer中含有Bam H I酶切位点，为克隆实验提供了方便。制品中的Control RNA及Control Primer可以
用于Control实验。
●制品内容
制品内容1～9为用于3′RACE实验的反转录用试剂，可用于20次反转录反应（约100次3′RACE PCR反应）；10～12为Control实验用试剂，可进行5次Control实验。
1.Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）（200 U/μl） 5 μl
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2.RNase Inhibitor（40 U/μl） 5 μl
3.5×M-MLV Buffer 40 μl
4.dNTP Mixture（10 mM each） 20 μl
5.3′RACE Adaptor（5 μM） 20 μl
6.RNase Free dH2O 1 ml
7.1×cDNA Dilution Buffer II 1 ml
8.3′RACE Outer Primer（10 μM ） 200 μl
9.3′RACE Inner Primer（10 μM ） 200 μl
10.Control HL60 Total RNA（500 ng/μl）* 5 μl
11.3′RACE Control Outer Primer（10 μM）* 10 μl
12.3′RACE Control Inner Primer（10 μM）* 10 μl
* 用于扩增Human Prohibitin（PHB）基因。
bind9【各种引物序列】
引物名称 引物序列（5′→3′）
3′RACE Adaptor 含有由TaKaRa独特设计的dT区域及Adaptor Primer部分
3′RACE Outer Primer TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT
3′RACE Inner Primer CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG
3′RACE Control Outer Primer GAGTGCAGGACATTGTGGTAGGG
3′RACE Control Inner Primer ATCTTTGACTGCCGTTCTCGACC
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【实验时需要自备的其他试剂】
1.扩增目的DNA片段的上游特异性引物。
2.PCR用DNA聚合酶。我们推荐使用TaKaRa LA Taq?（TaKaRa Code：DRR02AM），也可以根据实
验需要选用其他PCR用DNA聚合酶。
●保存： -20℃
●试剂盒原理
进行3′RACE 实验时，首先由Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）将Poly(A)+ RN
A反转录成cDNA，然后再使用TaKaRa LA Taq?（TaKaRa Code：DRR02AM），以反转录的cDNA为模板，进行套式PCR反应。3′RACE Adaptor Primer作为反转录引物用于cDNA合成（具体原理见图1）。
图1. 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0的实验原理图
1．以Total RNA为模板，使用3′RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成1st Strand cDNA。 2．使用上游外侧特异性引物（GSP1）和3′RACE Outer Primer进行1st PCR反应。如果1st PCR 反应未能得到目的产物，再使用上游内侧特异性引物（GSP2）和3′RACE Inner Primer进行2nd PCR反应。
3．PCR产物可以直接进行DNA测序或TA克隆。如果使用含有Bam H I酶切位点的上游内侧特异性引物进行2nd PCR扩增时，可以使用限制酶（Bam H I）对PCR产物进行酶切反应，然后克隆至相关的载体中。
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●特异性引物设计的注意事项
1.长度为20～24 bases。
2.GC含量50％左右，无二级结构等，并且与RACE Primer不能形成复杂结构。
3.应使用引物设计的专用软件进行设计。
●试剂盒特点
RNA模板 适用于所有Poly (A)+ RNA。
扩增片段大小我们曾经扩增得到8 kbp以上的DNA片段。
3′-RACE法 RT反应时使用3′RACE Adaptor，PCR反应时下游引物分别使用
3′RACE Outer Primer和3′RACE Inner Primer。
样品材料 也适用于目的基因丰度较低或者样品量较少的实验材料。
●RNA样品制备
本试剂盒是将RNA反转录成cDNA，然后再对cDNA进行扩增的试剂盒。RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂
中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套，使用RNA操作专用实验台，在操作过程中免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。
避
【使用器具】
尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿时应在使用前按下列方法进行处理。
（1）用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。
（2）然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。
RNA实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其他实验。
【试剂配制】
用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60分钟）或用上述方法进行DEPC水处
理灭菌后的玻璃容器盛装（也可使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后进行高温高压灭菌。
RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。
【制备方法】
使用简单的RNA纯化方法即可获得满足于RT-PCR反应的RNA（只需少量的RNA便可进行RT-PCR反应）。推荐使用TaKaRa RNAiso Reagent系列产品或其他RNA提取试剂、试剂盒进行RNA的提取。使用Catrimox-14TM RNA Isolation Kit Ver.2.11（TaKaRa Code：DWA005）可从血液中快速提取高纯度的Total RNA。使用本试剂盒进行RT-PCR反应时，每次反应所需的最适Total RNA量约为1 μg。
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●试剂盒使用注意事项
以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前请一定认真阅读。
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