文献编号:1003-6482(2003)02-0058-06
发光条件的初步研究
杜宗军，王祥红，李海峰，陈吉祥，李 筠
(中国海洋大学海洋生命学院，青岛 266003)
摘要：从青岛近海海洋沉积物样品中分离出一株海洋发光细菌，命名为D40。经过形态观察以及一系列生理生化特征测试结果，确定这株菌属于弧菌属(V ibrio )的哈维氏发光弧菌(V ibrio harv ey i )。同时对这株菌的发光条件和发光特点进行了初步研究，实验结果表明，细菌D 40在P H 7.5，温度30℃,NaCl 浓度为3.0%时，发光强度最高，液体培养4h 开始发光,6h 后，发光达到峰值，持续发光时间可达19h 。关键词：发光细菌；鉴定；发光条件中图分类号:Q935 文献标识码:A
发光细菌是一类在正常的生理条件下能够发射可见荧光的细菌，这种可见荧光波长在450～490nm 之间，在黑暗处肉眼可见[1]
。目前，全世界已发现和命名的发光细菌有11种，分别属于弧菌属(V ibr io )、发光杆菌属(P hotobacterium )、希瓦氏菌属(S hew anella )和异短杆菌
属(X enorhabdus )[2～3]。不同种类发光细菌的发光机理是相同的，是由特异性的荧光酶(LE )、还原性的黄素(FMNH 2)、八碳以上长链脂肪醛(RCHO)、氧分子(O 2)所参与的复杂反应。
发光细菌由于其独特的生理特性，在环境监测中被作为测定环境中毒物的指标[4～5]。发光细菌与外来受试物接触后，由于毒物具有抑光作用，发光细菌的发光强度即有所改变，变化的程度与受试物的毒性大小呈相关关系。发光强度的变化可以用发光光度计测出。用发光细菌来检测有毒物质，由于有毒物质仅干扰发光细菌的发光系统，费时较少且敏感性较好，操作简便，结果准确，在国内外越来越受到重视。发光细菌由于其独特的生理特性，与现代光电检测手段完美匹配的特点而备受关注，在环境监测中的应用也越来越广泛。
本文从来自胶州湾海洋沉积物中分离得到一株海洋发光细菌并进行鉴定，对这一株菌的发光条件和发光特点进行了初步研究。
1 材料和方法
[2,6]
1.1.1 海水2216E 液体培养基
蛋白胨5g ，酵母粉1g ，磷酸铁0.1g ，海水1000mL ,pH 7.6。
2003年
海 洋 湖 沼 通 报
T ransactio ns o f Oceanolog y and L imnolog y
N o -2
第一作者简介：杜宗军，男,1974年出生，硕士，讲师，从事海洋生物学及微生物酶学研究。
收稿日期:2002-09-20
1.1.2 海水2216E 固体培养基
在以上液体培养基中加入2%的琼脂即可。1.1.3 发光固体培养基
牛肉膏10g ，蛋白胨20g ，甘油10g ,NaCl 30g，琼脂20g ，蒸馏水1000m L,pH 6.9，调pH 后加CaCO 35g 。
1.1.4 发光液体培养基
切削机酵母膏5g ，胰蛋白胨5g,NaCl 30g ,Na 2HPO 45g,KH 2PO 41g ，甘油3mL 。以上培养基配好后,121℃灭菌20m in 备用。1.1.5 TCBS 培养基
TCBS 琼脂89.1g 溶于1升蒸馏水中，加入20g NaCl，加热煮沸至完全溶解，冷却至55℃备用。
1.2 实验方法
1.2.1 发光细菌的分离
将采自胶州湾海底的泥样用无菌海水稀释为10-3,10-4,10-5三个浓度，用涂布棒均匀涂布于海水2216E 培养基上,28℃恒温培养48h，进行暗室观察，挑取发出荧光的菌落。1.2.2 发光细菌的鉴定
对分离得到的发光细菌进行形态和生理生化特征测定，测定方法按照有关文献进行[7～8]。测定后，根据伯杰氏手册[3]
进行鉴定。
1.2.3 发光条件的研究
1.2.3.1 NaCl 浓度对细菌发光的影响：以含不同浓度NaCl 的蒸馏水代替海水，其它成分与海水2216
E 液体培养基的成分相同，配制NaCl 浓度分别在0%,0.5%,1%, 1.5%,2%,2.5%,3%,5%,7.5%和10%的培养基，接种发光细菌，培养24h 后观察生长和发光情况。1.2.3.2 pH 值对细菌发光的影响：配制pH 分别在5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0和8.5的海水2216E 液体培养基，接种发光细菌，培养24h 后观察生长和发光情况。 1.2.3.3 研究培养温度对细菌发光的影响：发光细菌接种于2216E 固体培养基，分别在4℃,20℃,25℃,30℃,35℃,40℃和45℃条件下培养，分别在24h 和48h 观察生长和发光情况。
1.2.3.4 研究液体培养时培养时间对细菌发光的影响：发光细菌接种于发光液体培养基,28℃恒温水浴培养3h,4h,5h,6h,7h,8h,9h,10h,11h,12h,16h,20h 和24h 后观察发光情况。1.2.3.5 研究不同培养基对发光细菌生长和发光的影响：将发光细菌分别接种于2216E 固体、液体培养基，发光细菌固体、液体培养基以及培养弧菌用的TCBS 培养基，固体培养条件为30℃,24h；液体培养条件为30℃振荡培养,6～24h 连续观察。网络狂飙
2 结果
通过分离、筛选，得到一株海洋发光细菌，编号为D40。2.1菌种鉴定结果
2.1.1 该菌株在海水2216E 固体培养基上的菌落为圆形，白，不透明，表面湿润，边缘整齐。在T CBS 培养基上的菌落为绿，且呈扩散状生长，生长极为旺盛。
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2期一株海洋发光细菌的分离鉴定及其发光条件的初步研究
60海 洋 湖 沼 通 报2003年
2.1.2 将发光细菌D40的特征鉴定结果绘制成表格，见表1，根据伯杰氏手册，该菌的各项特征与哈维氏弧菌(V ibr io harvey i)吻合程度较高，确定其为哈维氏弧菌。表格中哈维氏弧菌(V ibrio harveyi)的生理生化特征数据来源于伯杰氏手册。
2.2 发光条件的研究结果
发光条件的研究结果见表2～6。实验结果表明，细菌D40在PH7.5，温度30℃,NaCl浓度为3.0%时，发光强度最高，正常发光的温度范围在20～40℃,pH范围在6.0～8.0，液体培养4h开始发光,6h后，发光达到峰值，持续发光时间可达19h。对于不同培养基的实验结果表明，细菌D40利用2216E固体和液体培养基都可以正常生长和发光，利用发光细菌固体和液体培养基时，发光强度更高，在T CBS固体培养基表面生长旺盛，但不发光。
3 讨论
利用发光细菌用于环境中有毒污染物的检测是对其进行利用的一个重要方面。发光细菌常用于制备生物传感器的识别元件。被研究者所利用的发光细菌主要有明亮发光杆菌(P hotobacterium p hosp horeum)[9]和青海弧菌(V ibr io qinghaiensis)[10]。我国学者分离得到一株淡水发光细菌青海弧菌(V.qinghaiensis)[11]，并将其应用于环境样品的毒性测试[12]。目前，已经制作出了用于污染物毒性检测的细菌发光传感器[9]。中国科学院南京土壤研究所研制出GXY-2型生物毒性测定仪，利用此毒性测定仪和明亮发光杆菌(P hotobacterium p hosp horeum)，学者们在评价工业废水毒性[13]、诊断重金属污染土壤毒性[14]和蔬菜中有机磷农药残留的快速检测[15]等方面进行了应用。但目前我国的发光细菌传感器还难以进行有毒污染物的连续、在线检测，并且如何提高其检测专一性，也是有待研究的课题。
细菌能够稳定、高效、持续发光是其被用做生物敏感材料来制备识别元件的基础，因此筛选优良的菌种是传感器制作的关键之一。海洋发光细菌是海洋环境中的正常微生物，从海洋环境中分离优良的发光细菌菌株是可行的。
本实验从海洋沉积物中筛选出一株海洋发光细菌D40，经鉴定为哈维氏弧菌(Vibrio harvey i)，并对其发光条件和发光特点做了初步研究。研究结果表明，细菌D40正常生长和发光的温度范围在20～40℃,pH范围在6.0～8.0，具有较好的温度和pH适应性。在所进行的实验中，发光细菌培养基最适合细菌D40发光，细菌D40在TCBS固体培养基表面生长旺盛，但不发光，推测是因为T CBS培养基中的
某些抑菌成分抑制了细菌的发光。细菌D40液体培养时稳定发光的时间比较长，具有较好的应用前景。
表1 细菌D 40的形态、生理生化特征以及和哈维氏弧菌(V .har vey i )的比较
T able 1 M or pho lo gy and physio lo gical and biochemical char acter s o f
bacter ium D40and a co mpariso n with V .harv ey i
特征D 40V.harv eyi *
特征D40V.har vey i
直的杆菌++D-甘露糖醇+d 运动性++D -半乳糖--革兰氏染--L -阿拉伯糖--鞭毛极生++D -阿拉伯糖醇--接触酶反应++D -蜜二糖--氧化酶反应++D -棉子糖--葡萄糖利用发酵发酵L -鼠李糖--硫化氢反应+-D-山梨糖醇--发光
++蔗糖-d 精氨酸双水解酶--D -海藻糖+d 生长时需要钠离子++木糖醇--需要有机生长因子
++阿东糖醇--吲哚反应
-
+赤藓糖醇--o/129敏感-+甘油+-生长在:4℃--m -肌醇--20℃++乙酸--30℃++柠檬酸--40℃+D 丙二酸--45℃
--纤维二糖+d 形成:
麦芽糖++明胶酶++鸟氨酸
--淀粉酶++硝酸盐还原++几丁质酶
+D 生长在:
唯一碳源利用:
0%N aCl --
-D -葡萄糖+D 1%N aCl ++ -D-乳糖d -6%N aCl ++D -甘露糖
+
D
8%N aCl
--
注:*哈维氏弧菌(V .har vey i )的生理生化特征数据来源于伯杰氏手册，见参考文献3。“+”表示正反应,“-”表示负反应,“d ”表示11%～89%的菌株为正反应.
表2 Na Cl 浓度对细菌D40生长和发光的影响
T able 2 Effect o n the gr ow th and luminescence of D40by the concent rat ion o f NaCl N aCl 浓度
0.0%0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 2.5% 3.0% 5.0%7.0%10.0%生长-+′+++′++++++++′--发光
-+′
+
++′
++
++
+++
+′
--
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2期一株海洋发光细菌的分离鉴定及其发光条件的初步研究
62海 洋 湖 沼 通 报2003年
表3 pH对细菌D40生长和发光的影响
T able3Effect on the gr ow th and luminescence o f D40by the pH
pH值 5.0 5.5 6.0 6.57.07.58.08.59.09.5生长--++++++++++++--发光--++++++++++++--
表4 温度对细菌D40生长和发光的影响
T able4Effect on the g ro w th and luminescence of D40by culture temper ature 培养温度4℃20℃30℃35℃40℃45℃生长-+++++++++-
发光-+++++++++-
表5 培养时间对液体培养条件下细菌D40生长和发光的影响
T able5Effect on the luminescence of D40by t he culture time in liquid cultur e
时间(h)34567891113151719212324发光-+′+++++++++++++++++′++++′+′-
表6 不同培养基对细菌D40生长和发光的影响
T able6Effect o n t he g r ow th and luminescence of D40by different media 培养基2216E液体2216E固体发光固体发光液体T CBS
生长+++++++++++++
发光++++++++++-
注:-：不生长或不发光 +：生长或发光 +′：弱生长或弱发光
参考文献:
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ISOLATION AND IDENTIFICATION OF A LUMINOUS BACTERIUM D 40AND PRIMARY STUDIES ON ITS
LUMINESCENT CONDITIONS
DU Zongjun ,WA NG Xiang hong ,LI Haifeng ,CHEN Jix iang ,LI Yun (Colleg e of M arine Life Sciences,Ocean U niv ersity o f China,Qingdao 266003)Abstract :A lum inous bacterium ,D 40,was isolated from the m ar ine sediment samples co llected in Qingdao o ffshore .Based on the mo rpholo gy and the physio logical and bio chem ical characters,strain D40w as identified as Vibrio harveyi .The prim ary luminescent co nditions w ere determ ined.In liquid culture,the results of the study o n the cultural co nditions o f luminous bacter ium D 40show that pH 7.5,30℃,w ith 3%NaCl ,are the optim al conditions.T he luminescence begins after 4hours ′cultiv ation and lasts for 19hours ′w ith a peak after 6hours ′cultiv ation.
Key words :lum inous bacterium ;identificatio n ;luminescent conditionsdeadpixeltest
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2期一株海洋发光细菌的分离鉴定及其发光条件的初步研究
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