温度依赖型性别决定的分子机制聂刘旺 (安徽师范大学生物系，芜湖241000) 多数爬行动物缺乏异型性染体，它们的性别不是在受孕时决定，而是由孵化卵的温度来决定的。温度依赖型性别决定的现象早在三十年前就被发现，但有关其机制的研究少有进展。在过去的几年里，由于SR Y基因的发现，对XY染体(或遗传的)性别决定(GSD)机制的分子基础的研究已取得重大进展。现今，比较TSD和GSD机制已成为可能。TSD已在一些进化上较古老的脊椎动物中发现，由此人们推测它是一种较古老的性别决定形式。而GSD机制由此进化而来。如果这一推测是正确的话，那么，这两种机制就可能共享了一个共同的分子途径。本文对TSD机制的目前研究作了一介绍，提出了一些必须解决的问题，以便更好地理解TSD机制的分子基础。
1 TSD机制的概述:
发育的胚胎所产生的最典型的结果之一是性别决定。物种的延续依赖于胚胎分化形成雄性或雌性个体的能力，因而，性别决定的机制一定是十分健全。自然界中，性别决定的机制有多种类型:11染体(遗传型)性别决定;21环境性别决定。31孤雌生殖。环境性别决定是指子代的性别归宿于胚胎发育的环境信号而不依赖于合子的遗传组成。许多的遗传因子可以影响胚胎的性别发育，如密度，含水量,p H值，最典型的是孵化温度。TSD最主要的特点是较小的孵化温度的改变能够决定子代是否为雄性或雌性。因而，多数孵化温度下，子代的性比(♂/♂+♀)总是出现明显的偏差。
具有TSD现象的物种通常总是缺乏性染体。目前，在几乎所有鳄类动物中均发现为TSD类型，龟类和蜴动物既有TSD类型，又有GSD类型，而几乎所有蛇类仅发现存在GSD机制。美洲的密西西比鳄是目前最被广泛研究的一种具TSD机制的动物，在这一动物中,30℃或低于30℃下的孵育温度将产生100%的雌性,33℃产生100%的雄性,35℃则产生大约90%的雌性，而其间的温度则产生不同的性比。这种雌———雄———雌FMF〔型性别决定〕不仅在密西西比鳄中存在，在其它具TSD机制的物种中也十分多见。
亲缘关系较近的爬行动物种间，即有GSD又有TSD机制的现象，使得我们可以相信，这两种机制的进行过程可能是相似的，导致性腺分化的因子在哺乳动物和爬行动物中可能是十分保守的。因此，在爬行动物中，已被分离和鉴定的具控制哺乳动物性腺发育的基因可能在爬行动物中具有类似的功能。通过对哺乳动物性别决定分子遗传的研究，我们可以推断在TSD 机制中的分子面貌。
2 爬行动物中与性别有关的特异DNA序列的发现如前所述，蛇类大多是雌性异配性别，性染是ZW。Singh等于1980报道，他们在印度产的一种雌蛇中(Bungarus fasciatus)分离到一种高度重复的卫星DNA序列(B KM)。继后又发现B KM在海龟中也存在性别特异性；用B KM探针与原始种类的蛇如蟒科的Ergxjohni和Xenopeltis U nicolor进行杂交时，发现这种与性别有关的序列散布在许多大型染体上，这些原始种类的蛇没有异型性染体，这类探针与小鼠染体进行原位杂交，则显示位于雄性小鼠Y染体近着丝粒区，因而人们推测B KM在脊椎动物性别决定机制中起一定作用。研究表明,B KM
具有许多G A TA或G ACA的重复单位，它们在性反转小鼠中Xsxr区段与编码睾丸决定基因(Tdf)的序列相连，因而，表现为随Tdf而被动转录;Y染体上靠近Tdf位点的G A TA 重复序列的大小似乎相当随机而与性别决定无关；人类的Y染体上几乎不含这一序列更加证实B KM与性别决定关系不大。
3 爬行动物H2Y抗原基因
H2Y抗原是一种雄性特异的组织相容性抗原，在脊椎动物的进化过程中高度保守，广泛存在于人和脊
椎动物的异配性别中(XY型性别机制中存在于雄性中;ZW则存在于雌性中)。Zaborski等于1970年提出, H2Y抗原在龟类中是睾丸决定因子(Tdf)，而温度可使这种蛋白的作用发生逆转。然而，对H2Y抗原以及这种性逆转龟(S iebenrockiella crassicollis)的进一步研究表明，其雌性为H2Y阳性，而雄性却为异配性别(XY 型)。从而否定了H2Y抗原基因是Tdf。Bull也从理论背景上进行了阐述，他认为如果TSD机制是从GSD机制(XX/XY型)进化而来的话，那么在转变成TSD时，要么X染体要么Y染体可能会丢失，从而TSD种类不存在有异配性别；之后的文章中，他进一步认为两种性别间没有遗传差异是ESD机制的先决条件。但实事上，爬行动物仍然具有H2Y抗原，且仍为雄性特异抗原。Mardon等在对一种性反转小鼠的实验结果表明，虽然性反转小鼠(XXsxr)仍有睾丸，但却检测不到H2Y原，也否定了H2Y抗原的理论。
草虫的村落教学实录近年的实验表明,H2Y抗原基因位于小鼠Y染体的短臂上，与小鼠Tdf紧密连锁，但并非同一基因。对
人类性反转患者的研安也表明H2Y抗原位于人类Y 染体的长臂上，而人类TDF则位于Y染体的短臂上。进一步研究还发现人类X染体上也存在同源基因Z fx，因此，现在人们倾向认为,H2Y抗原是一种重要的睾丸分化因子，但不是唯一的和主要的睾丸诱导因子。
4 爬行动物ZF Y基因的研究
一般认为,ZF Y基因所编码的锌指蛋白是一种转录因子，在基因转录水平上，与DNA结合，可能起调控睾丸的作用。鉴于这一推测，早在1988年,Bull等采用人类的ZF Y探针pDP1007与几种爬行动物的基因组DNA进行了杂交检测，发现爬行动物中存在ZF Y同源序列。这种保守性和广泛性也得到了Valleley等的证实。他们克隆了密西西比鳄的ZF Y同源基因Z fc，并进行了序列测定，结果显示，在氨基酸水平上,ZF Y和Z fc 具有91%的同源性。这种同源性说明了由这一基因编码的功能也具有同源性。1994年Spotila等从蛇鳄龟(Chelydra scrpentina)中也克隆了该基因(Z fc)，序列分析与人、小鼠、家鸡、鳄类均具有较高的同源性,DNA 序列的同源性从80%—98%，氨基酸序列的同源性从65%—96%。
鳄类和龟类中，其两性性别均发现有ZF Y同源基因的存在；其表达研究表明，鳄类在胚胎发育期间，多个组织中均有该基因的活性表达，没有证据表明Z fc有性别特异性的功能。因此，它在TSD机制中的作用尚不清楚，它不是性别决定的主要信号，而是可能在性别分化的级联作用中担任某一角或是作为一般的转录因子。
5 爬行动物SR Y基因的研究
SR Y是目前大家公认的TDF最佳候选基因。1991年,Tiersch等利用哺乳动物SR Y保守基序区的一个探针对多种脊椎动物进行了杂交分析，性别特异的杂交带仅出现在人和哺乳类、而在鱼类、鸟类、爬行类和无颌类等雄性和雌性中均有一致的杂交带，没有性别特异性，在爬行动物中，具有GSD或TSD的种类间也无性别特异的杂交带型。迄今，已有两种具有TSD机制的爬行动物(A lligator missippiensis和Chely2 dra serpentino)进行了SR Y2box基因的克隆和序列分析。在鳄类中,SR Y2box基因主要有三种类型，其相似性分析表明，它们与小鼠SOX基因的相似性程度比与人类SR Y基因或小鼠Sry的相似性程度更高，这种相似性可能反应了功能上的同源性，至于对性别决定的作用，尚需进一步研究,S potila等从龟类中克隆的SR Y2box基因也具有上述同样的特点。他们在龟类中克隆到10个SR Y2box基因(Sra)，它们与鸟类(L arus f uscus)等的SR Y2box基因(由常染体编码)也具有较高的同源性，其范围从40%—81%。最近，作者对中国产三种龟类(平胸龟Platysternon megacephalum、乌龟Chinemys reevesn、中华鳖T1sinensis)的SR Y2box基因进行了初步研究。采用能特异扩增男性SR Y保守序列的一对引物对三种龟进行PCR扩增，该引物能特异扩增SR Y基因的开放阅读框架，扩增产物为482bp。结果显示，三种龟的PCR扩增产物与人的一致，也为482bp。该产物经过southern转移能与SR Y探针p Y53.3特异杂交，且只显示一带。PCR产物经单链构象多态检测表明，中华鳖和平胸龟的雄性和雌性间没有大小差异；鸟龟在两性间的差异不明显，三种龟与人(男)的片段差异也很小。表明该序列在人和龟类中相当保守，其同源性大小和在性别决定中的作用则尚待研究。
爬行动物的SR Y2box基因在胚胎发育过程中的表达研究进行得较少。目前仅在美国密西西比鳄中进行过有关研究，他们采用PCR产物作为探针，以检测鳄类SR Y2box基因的胚胎表达和一些组织特异性，结果表明，从胚胎发育的第3、16和20期(stages)取得的胚胎总mRNA与探针杂交没有显示有发育时期的特异
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性，而在不同的组织中，同一发育时期的组织表达差异也不明显。在人类中,SR Y基因只在睾丸组织中表达，而在卵巢、肺和肾中均不表达，此外SR Y虽然在成年期睾丸组织中持续地表达，但迄今并未发现有与期在生殖嵴中类似的功能活性，这充分说明SR Y基因的表达具有空间和时间特异性。一般认为,SR Y是一种转录因子，通过对其它基因的表达调控而对雄性性别的分化起开关作用。爬行动物中,SR Y2box基因的表达未见有类似哺乳动物SR Y基因表达的时、空特异性，因而其在性别决定中的作用有待进一步研究。
6 爬行动物TSD的分子机制
目前为止，关于TSD分子机制，国外学者作了不少工作，现主要有以下几种观点:
611 构象改变(Conformational change)学说
Johnston(1995)认为，温度会影响SR Y蛋白的表达或活性，从而激活雄性性别分化途径或抑制雌性分化途径。这一假说的实验基础来自于对美国密西西比鳄(FM型)的研究。该种的雄性决定基因的表达是温度依赖型，在较高的孵育温度下，性别决定的敏感时期中，一些基因的产物过度表达，从而确定了雄性发育，而在较低温度时，这些基因的产物含量则较低。这些过度表达的产物作用途径是什么以及功能如何迄今尚不清楚。构象改变学说似可解释FM型或MF型TSD 机制。但对FMF型性别决定来说，温度对构象的改变则至少有两种形式。如美洲产的一种鳄中，孵化温度在31℃以下和35℃以上均发育成雌性，中间温度则为雄性。Johnston推测，在这样的一些种类中，决定雄性发育的蛋白构象可能要求十分严格，只有在适合的温度下，才能产生雄性发育的特异构象；而对于雌性发育而言，其构象的改变影响不大。因而，仅在某些范围较小的温度下孵育才能产生雄性，而雄性则在多种温度下可以产生。
612 阈值假说(The threshold hypothesis)
Deeming(1988,1989)认为睾丸的发育依赖于胚胎发育关键时期雄性决定因子(male determin factor, MDF)的产生，在适宜的温度下,MDF的积累达到某一阈值水平就发育成雄性，若达不到就发育成雌性。这一假说可以解释某些种类在一特定温度下，胚胎即可发育成雄性又可发育成雌性的现象，这可能是不同的胚胎产生MDF的速率不同而导致的。Smith(1994)对密西西比鳄的胚胎性腺发育观察表明，在发育的特定阶段，足细胞(sertoli cell)的阈值数量达到一定值后，胚胎就发育成雄性，否则就发育成雌性，因此，足细胞可能就是MDF。
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然而,TSD机制可能比上述的情形更为复杂，研究表明与雌性决定因子
(Female determing factor,FDF)也有关。在受精卵开始孵化时，所有胚胎都具有发育成雄性或雌性的潜能，如果在温度敏感期之前,FDF己积累到某一阈值水平，胚胎就发育成雌性，而此后的温度变化将不会产生影响。这一推测可用孵化卵的温度变异试验来证实。如某些鳄类(MF型,33℃以下为雌性, 30℃以下为雄性)产下的卵，在温度敏感期之前，先孵育在34～35℃，而在温度敏感期转移到30℃以下来孵化对某些胚胎性别无影响，子代总有一定数量的雌性个体，这可能就是在34～35℃时,FDF产生较快，积累值已经达到一定水平的缘故。
613 类固醇激素效应
图1 鳄类在三种不同温度下性别决定的模式
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fig2 The hypothetical schemes of sex determination of Alligator at three different temperature
发育中的胚胎用激素处理可改变性腺的分化(Johnston,1995)，在产生雄性的温度下，雌二醇可刺激卵巢的分化。两种龟类的研究表明(Gutzke,1988; Wibbels,1991)，类固醇的敏感时期与温度的敏感时期大致平行且对性别决定有协同效应。睾酮也可诱导卵巢发育，这是由于睾酮芳构化(aromatization)成为雌二醇。非芳构化的雄性激素对性腺分化产生雄性效应。这些实验表明，具TSD的爬行动物雌性的发育是一个被动状态，一些条件作用于它可诱导雄性的发育，这与雄性发育是由于特殊因子的积累是一致的。类固醇激素有两个效应:(1)外界条件不适于MDF的迅速积累时，胚胎发育成雌性(2)如果温度
和雌二醇具有共同
的生理途径，则激素可促使雌性的发育。
614 温度修饰模型
Spotila 等(1994)认为,TSD 机制是一种未分化的
性腺发育的修饰过程，这种修饰过程归因于一个或多个特异DNA 序列的差异表达，而这种表达又受到某一温度敏感的过程或类似于蛋白一样分子的基因产物不同作用所控制。图3为TSD 的一个模型，该模型认为温度作为修饰剂(媒介)改变了X 分子的空间构型，在产生雄性的温度上,X 结合到增强子上，这样就大大刺激了基因转录，产生大量的睾丸分化所必需的基因产物，而在雌性产生温度下，分子X 有不同的构型，其不能与增强子结合，从而仅有少量的基因产物，性腺则发育成雌性
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图2 TSD 机制作用的机理模
Fig3 The pattern of the temperament madifying
上述的假设模型虽没有直接的证据，但已有一些实验结果是支持的:(1)在性别决定的温度敏感时期
(指性腺从未分化到开始性别分化的转变时间)(ther 2mosensitive )有多种内源类固醇类激素和促类固醇生成
的酶存在。(2)大量的研究显示外源类固醇激素处理，能够掩盖温度的作用，诱导卵巢或睾丸的发育。(3)对龟类(M aloclemys Terrcpin.TSD )的实验表明,p450芳香化酶(Aromatase )抑制因子能显示破坏卵巢的分化。
(4)有一些证据认为雌激素和温度可能作用在同一生
理途径上。(5)对E 1orbicularis 的研究表明，在诱导雌性产生的温度下，性腺中雌激素量比诱导雄性产生的温度中的要高得多，且芳香化酶的活性也要高许多，这是由于在雌性诱导温度下，芳香化酶大量产生的缘故。对于芳香化酶基因表达的调控，虽然在爬行动物中尚未进行研究，但来自哺乳动物研究结果，则显示其与
SR Y 基因有关。因此,TSD 机制似乎也和哺乳动物一
样，由温度引起SR Y 的表达，从而启动性腺发育的一系列级联作用。
对于上述的假设，尚有许多问题需要解决，首先是温度变化如何转变成分子信号?这种信号的受体是什么?它的传递途径如何?等等。因此，这一问题的研究不仅可解决爬行动物性别决定机制，也会使人类性别决定之谜得以解开。
TSD 和GSD 两种机制在分子不平上的一致性
尽管目前对TSD 机制的细节尚不清楚，然而越来越多的迹象表明，其性别决定的策略与GSD 可能十分相似。其论据有如下几个方面:(1)龟类和蜥蜴中，亲缘关系较近的种间既有GSD 机制又TSD 机制；在某些鱼类的种内，依据生活的环境不同，既可采用GSD ，又可采用TSD ，如一种太平洋银鱼(Menidia menidia )，其北部的体显示为GSD ，而较南部地区的体则显示为TSD 。这些现象说明这两种机制的本身也具有极其相近的关系。(2)由于人类和哺乳动物的性别决定机制研究的长足进展，如今在具TSD 机制的物种中采用同样的研究策略已成为可能。遗传的同源性比较可知，在GSD 机制中性别特异的DNA 序列在TSD 机制的物种中同样存在，如上述的B KM 、ZF Y /ZFX 和S ox 基因。SR Y 已被认为是人类和哺乳动物性别决定的最
佳候选基因。其它的S ox 基因家族的成员在性别决定中也起重要作用，如S ox9基因作用于SR Y 基因的下游，其突变可导致人类性反转。在具TSD 机制的爬行动物中普遍存在多个S ox 基因，表明两者的性别决定具有较好的遗传同源性。结语:
综上所述，爬行动物的性别决定机制具有多种类型，在爬行动物各大类中分布很广，有些科、属甚或同一种不同居中也有多种性别决定机制分布。这种广泛的分布，说明了爬行动物在性别决定机制的起源上有独到的研究价值。
爬行动物性别决定分子机制的研究表明，它们如同高等哺乳动物一样，具有特异DNA 序列(B KM )和性别特异的H 2Y 抗原，以及与睾丸形成(决定)有关的
SR Y 2box ,ZF Y 同源序列存在，说明其起源是相同的。
系统分析认为，哺乳动物SR Y 基因来于早期爬行动物
SR Y 2box 基因的染体重排。至于SR Y 2box 基因的功
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能则尚待进一步研究。
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