魁蚶(Scapharca broughtonii)四个地理体遗传结构的RAPD分析 梁超1,2, 杨爱国1, 刘志鸿1, 周丽青1, 吴彪1
读写算（1农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室，中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛 266071；2.
上海海洋大学水产与生命学院，上海 200090）
无锡沦陷日
摘要：应用RAPD标记技术对魁蚶(Scapharca broughtonii)一个韩国体与三个中国体的遗传多样性进行RAPD 分析。对四个体133个个体进行扩增，共检测到171个位点，其中多态性位点为167个，四个体的多态性位点比例：韩国体为86.55%、黄岛体为90.06%、蓬莱体为85.96%、前三岛体为89.47%；四个体Shannon’s多样性指数为0.4599±0.2323～0.4913±0.2136，Nei’s多样性指数为0.3083±0.1707～0.3310±0.1992，表明四个体遗传多态性较高；四个体遗传分化指数在0.0058～0.1214之间，其中韩国与中国的三个体分化明显，说明韩国与中国三个体的遗传结构差异较大，黄岛体与前三岛体间的遗传分化最小。基于四个体Nei’s遗传距离的UPGMA聚类分析显示，黄岛体与前三岛体最先聚类，两体间距离最短，再与蓬莱体聚类，最后与韩国体聚类。这些数据可为魁蚶的种质资源的合理开发和保护及遗传改良提供科学依据。关键词：魁蚶；遗传多样性；RAPD；
RAPD Analysis of genetic variations in four geographical populations of Scapharea
broughtonii
LIANG Chao1,2 YANG Ai-guo1LIU Zhi-hong1 ZHOU Li-qing1 WU Biao1
(1 Key Laboratory for Sustainable Utilization of Marine Fisheries Resources, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries
Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071)
(2 College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, 200090)
ABSTRACT RAPD technology was used to analyze the genetic variations and genetic structure in four geographical populations of S capharea broughtonii from Korea and China. 171 loci were detected in the four populations through 25 random primers, and 167 of these loci were polymorphic. The results indicated that the genetic diversity of the four populations was rich. The Shannon’s index ranged from 0.460±0.232 to 0.491±0.214, and the Nei’s genetic diversity index ranged from 0.308±0.171 to 0.331±0.199. G st values showed that there are significant genetic differentiation between Korean population and the three Chinese populations. The UPGMA dendrogram of four S.
broughtonii populations based on Nei’s (1972) genetic distance showed that Huangdao and Qiansandao populations clustered first, then clustered with the Penglai
population, before further clustered with the Korean population. The UPGMA dendrogram gave a clear division between the Korean and Chinese populations. The information of the genetic variation and differentiation among four S. broughtonii geographical populations can be useful for conservation of S. broughtonii stocks and future genetic improvement by selective breeding.
KEY WORDS Scapharca broughtonii Genetic diversity RAPD
魁蚶（Scapharca broughtonii Schrenck）隶属软体动物门（Mollusca），瓣鳃纲（Lamellibtnchia），列齿目（taxodonta），蚶科（Arcidae），俗称赤贝、血贝、大毛蛤，是一种大型冷温性蚶类，广泛分布于太平洋西部沿岸，日本北海道以南，朝鲜、菲律宾、俄罗斯东南部。在我国主要分布辽东半岛东南部，山东半岛北部和东部等海区。分布区从近岸水深3m到外海近60m处，喜泥质或泥沙质海底（刘世禄，2005）。魁蚶成体个大体肥，肉质鲜美，经济价值很高，近年来由于市场和出口大量需求，自然资源远远不能满足市场需求，人工养殖得到大力发展，在魁蚶养殖生产实践中，中国魁蚶在生长速度、成活率等生物学指标方面与韩国魁蚶有一定的差异，养殖单位比较认可韩国的魁蚶苗种，使许多苗种生产单位每年从韩国引进魁蚶种贝进行苗种生产。
对中国与韩国的魁蚶种进行遗传多样性分析，了解这两地理区域种的遗传背景和遗传差异状况，以及这种遗传上的差异是否是这两个异域种在生长速度成活率等生物学指标表现出差异的原因，对魁蚶的种质资源的合理开发和保护及遗传改良都具有重要理论和现实意义。重型机械标准
iea近年来，RAPD技术已广泛应用于水产动物的遗传背景研究，Carcia（1995）等用RAPD技术研究了斑节对虾Penaeus monodon的遗传变异，并讨论了此技术在对虾选育育种中的应用前景；常亚青（2004）等用RAPD技术对5种经济海胆基因组DNA多态性进行了研究；Patwary（1994）等采用RAPD技术研究了扇贝(Placopecten magellanicus) 的遗传结构；沈怀舜（2003）等用RAPD技术对我国沿海三个文蛤(Meretrix meretrix)的地理种进行了遗传差异分析，到了区分三个种的遗传标记。高悦勉（2007）等对虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）、海湾扇贝(Argopecten irradians)、栉孔扇贝（Chlamys farreri）三种扇贝进行遗传结构的RAPD分析.刘萍（2007）等利用RAPD技术进行了中国对虾生长性状相关遗传标记的筛选与克隆，王庆恒（2006）等利用RAPD技术分析了光裸星虫遗传多样性。有关于魁蚶不同地理种遗传多样性方面的研究较少，喻子牛（1997，1998）等采用淀粉凝胶电泳技术研究了青岛近海魁蚶体的等位基因酶遗传变异和对秦皇岛、大连、青岛、韩国釜山4个魁蚶体样本的等位基因酶遗传变异。Eun-Seob Cho（2007）用COI序列对韩国、俄国、中国的魁蚶体进行了遗传结构研究。针对在养殖过程中，中国魁蚶与韩国魁蚶体表现出来的差异，本实验采用RAPD技术对中国和韩国魁蚶地理种进行了遗传多样性、遗传变异等研究，分析体之间
那一课的差异大小以及能否利用这种差异进行遗传改良。以期为今后魁蚶种质资源保护和遗传育种提供遗传学资
料。
1 材料与方法
1.1 材料
四个体的魁蚶于2007年8月至10月分别随机采自于山东蓬莱（SP）、山东黄岛（SHD）、江苏前三岛（JQ）、韩国统营（Korea）四个海区，均为自然体，样本数量分别为,31、38、36、28.。
彭述之1.2 基因组DNA提取
将魁蚶解剖，取100mg左右的外套膜肌肉加入1.5mLEffendorf管中，加入475µL抽提缓冲液(Tris-HCI 10mM, PH8.0; EDTA 10mM, pH 8.0)，剪碎后，加入25µLSDS(10%)和5µL蛋白酶K(20mg/L)，55℃水浴消化3-4h，消化液用等体积的酚抽提10min，离心10min（12000r/min），取上清，用等体积氯仿：酚(1:1)抽提两次，离心10min（12000r/min），取上清，用等体积氯仿抽提10min，离心10min （12000r/min），取上清加入1/25上清体积的NaCl (5M)溶液和2倍体积的冰无水乙醇，出现絮状沉淀，-20℃放置30min， 12000r/m离心10min，沉淀用70%的乙醇洗涤2-3次后，常温下晾干，加入50
µL TE(Tris-HCl 10mM, pH 8.0；EDTA 0.1mM, pH 8.0)溶解成母液，-20℃保存备用。对母液用核酸定量仪结合1%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA浓度和质量检测。
1.2 RAPD反应
RAPD扩增反应总体积为25µL，包括10×PCR反应缓冲液2.5µL；dNTPs(2.5mM)2µL
MgCl2(25mM)1.5µL；Taq酶(5U/µL)0.3µL；随机引物(5µM)2µL；基因组DNA2µL(50ng/µL)，用超纯水将反应体系补足到25µL。反应体系在EPPENDORF Mastercycler gradient 5331PCR仪器上进行扩增，经94℃预变性5min后，进行45个扩增循环，每一个循环包括94℃变性45s，37℃退火1min，72℃延伸2min。最后在72℃延伸10min。扩增产物于1%的琼脂糖凝胶电泳，EB染，UVP凝胶成像系统下观察记录。
1.3 数据统计分析
记录下电泳后清晰的扩增条带，每一个个体的扩增条带按有或无记录。出现扩增条带记录为1，无扩增条带记录为0，每一条片段作为一个基因位点进行分析。应用POPGENE VERSION1.31软件对四个体的遗传学参数进行分析：
多态位点比例P=多态扩增片段数/扩增片段总数；
Shannon多样性信息指数I = -∑P i㏑P i，P i为位点i在某一体中出现的频率（Chlmers K J et al,1992）；
遗传分化指数G st =（H T-H S）/H T，H s是各体内遗传多态性平均值指数，H T是总体的遗传多态
性指数(Nei 1973)；
体间的相似性指数 I = J XY/(J X J Y)，J X是体X体内所有位点基因一致性的算术平均值，J Y是体Y内所有位点基因一致性的算术平均值，体间的遗传距离是D = -㏑I(Nei)；
根据遗传距离值，采用UPGMA方法对体进行聚类分析。
表1 随机引物及其序列
Table 1 Primers used and their sequences
2 结果与分析
2.1 PCR扩增结果
实验从80个随机引物中筛选出扩增带清晰、重复性好的25个引物，其引物序列与名称见表1。四个魁蚶体共产生171个条带（例如图1），片段大小在100-3000bp之间，其中多态性条带为167条，多态
位点占所有扩增位点的97.66%。分别统计魁蚶四个地理种扩增结果，其多态位点比例大小顺序为黄岛体＞前三岛体＞韩国体＞蓬莱体（表2）。
表2 魁蚶四个体多态位点数目与多态位点比例
Table 2 Number of polymorphic loci and percentage of polymorphic loci in four populations of S.
broughtonii
多态位点数多态位点比例
The number of polymorphic loci The percentage of polymorphic loci Korea14886.55%
SHD15490.06%
SP14785.96%
JQ15389.47%
总计16797.66%
图
图2 引物S305在韩国体中扩增结果
Fig. 2 The band amplified fragment by S305 in Korean population of S. broughtonii
2.2 体遗传多样性和遗传分化
四个体中，Shannon’s多样性指数与Nei’s的多态性指数都显示蓬莱体的最低分别为0.460、0.308，黄岛体最高为0.491、0.331（表3）。
中国体和韩国体总体遗传多态性指数H T为0.361，各体内遗传多态性平均值指数H S为0.323.，体发生的遗传变异有90.2%存在于体内，9.8%存在于体间。
魁蚶四个体遗传分化指数为0.006～0.121，其中韩国体与黄岛、蓬莱、前三岛三个体之间的遗传分化指数分别为0.106、0.121、0.107，而黄岛、蓬莱、前三岛三个体之间的分化指数在0.006～0.053，说明韩国体与这三个体之间发生较大遗传分化，而中国三个体之间遗传分化不大，其中黄岛与前三岛两个体之间的分化指数最小，为0.006（表4）。
表3魁蚶四个体之间的Shannon’s多样性信息指数和Nei’s基因多态性数值
Table 3 Shannon’s information index and the Nei’s gene diversity in the four populations of S. broughtonii
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