中国药理学通报Chinese Pharmacological Bulletin2022Doc；36(12)：1661〜7-1496•网络出版时间：2220-16-318：/3网络出版地址：https：//kns.cakh net/kcms/demil/34.1086.R；22221222.1517.248.html
许冰馨2王琪珊2李钦2范凯健2朱静艳2王婷玉6
（上海交通大学医学院附属第九人民医院0药剂科、2.药剂科静脉药物配置中心，上海200211）
doi：21066/j.issn.1021-1978.2222.12.212
文献标志码：A文章编号：1421-1978（2222）12-1691-26中国图书分类号：R-337；R379.85；R374.5；R593.22；R684.3；R977.11
摘要：目的研究地塞米松对胶原诱导性关节炎（collagen indnceX arthritis,CIF）大鼠关节疼痛的改善作用。方法除6只正常组外，其余29只Water大鼠被随机平均分模型组和给药组、建立CIF模型，给药组腹腔注射地塞米松（1my•kg"），每周3次，连续4周。Vw Frey法测机械性缩足反射阈值。给药4周后，处
死并采集血清、滑膜、背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）o采用Real-Cme PCR方法检测滑膜和DRG中炎症因子mCp、mA、、LC7、TNFA以及DRG 中疼痛指标神经肽Y、瞬时感受器电位香草酸受体1、神经生长因子以及脑源性神经营养因子的mRNA的表达。酶联免疫吸附法（enzyme-Cnked immuuosorbent assay,ELISA）测定大鼠血清中IP-17A和TGFp1的含量。结果地塞米松能明显降低CIF大鼠滑膜、DRG以及血清中炎症因子的表达，提高TGFp1表达；降低DRG中疼痛相关因子表达水平，从而起到缓解CIA关节疼痛的作用。结论地塞米松对CIF大鼠具有缓解局部关节炎症和缓解疼痛的作用。 关键词：类风湿关节炎；胶原诱导关节炎；机械疼痛阈值；地塞米松；背根神经节;ELISA
类风湿关节炎（rhecmatoid arthritis：RA-是一种自身免疫性疾病，常出现多个关节的持续性疼痛，严重时还可导致骨破坏、骨质侵蚀、关节畸形和功能丧
收稿日期：2929-08-l1，修回日期：2727-12-17
基金项目：国家自然科学基金资助项目（No81501551,81572164, 81870211-；上海市科委科研项目（No181****3522-
作者介绍：许冰馨（1989--，女，硕士生，研究方向：药理学,E-mail：150****************；
王婷玉（1682--，女，博士，副主任药师，硕士生导师，研
究方向：药理学、临床药学，通讯作者，E-mSl“rtywang®
123h com 失。长期的慢性关节疼痛常发生在手、足小关节中，是影响患者生存质量的重要因素。RA疼痛可能由不同病因造成，如外周炎症、中枢神经系统失调以及精神因素等。尽管目前对于RA疼痛的有抗风湿药、镇痛药、抗抑郁药和抗癫痫药，但仍有许多患者的疼痛未能治愈[6]o因此，只有了解RA疼痛的根本原因，才能有效地进行疼痛。
背根神经节（dorsal root yanyliod,DRG-是连接在脊髓背根两侧的膨胀结节，负责接收身体感受器的神经冲动，再将信号传递到脊髓。DRG在神经性疼痛的产生与持续中发挥重要作用，故研究DRG中与疼痛机制密切相关的离子通道及其受体、相关神经生长因子都是实现DRG靶向镇痛的关键[2]o 地塞米松（dexamethasone:DEX-属于长效的糖皮质激素，具有强大的抗炎、抗风湿和免疫抑制作用。现有临床数据表明，DEX可以迅速缓解RA患者关节肿胀和疼痛，减少骨侵蚀、降低炎症因子的表达，且效果长久且安全[0]o虽然DEX联合抗风湿药物的临床研究有很多，但是关于DEXRA动物模型的DRG疼痛的作用机制的研究相对较少。故本文通过在Wistor大鼠上建立胶原诱导性关节炎S cahayen-induced sthritis,CIF）模型，并给予DEX（6mg•kg-6）腹腔注射。通过观察大鼠后足机械痛阈改变、检测血清中炎症因子水平、检测DRG 中炎症因子、疼痛相关的神经生长因子、离子通道受体表达水平的改变，来确定DEX对CIF大鼠疼痛与炎症的调节作用和潜在的机制。
1材料
1.1动物32只SPF级Wistor大鼠，6,6~8周龄，体质量（160±20）y，购买和饲养于上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物中心。动物生产许可证编号:SCXK2沪）2018-6016，使用许可证编号:SYXK2沪）2216-0216。除16只正常组外，其余22只被随机、平均分成模型组和给药组，于温度（22±2-C，相对湿度为50%-64%,16h明暗交替的通风环境中适应喂养6周。本实验已通过上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物伦理委员会
-1642•中国药理学通报Chinese Pharmacological Bulletin2420Dcc；33(12)
批准。
1.2试剂牛I型胶原（Chondrea公司，批号177666）、弗氏不完全佐剂（Chondrea公司，170594）、
地塞米松（Stemceli technoWpivs，批号BX27114）、TRIzol（美国Ambiox公司，批号154965）o PCR弓|物（上海生工生物科技有限公司）、SYBR Green qPCR Mastvo MO（日本TaKaRn公司，批号522077）、大鼠IC-17A ELISA试剂盒（MukiscOuces公司，批号031780133）、大鼠TGF-pl ELISA试剂盒（Multl-sciexcvs公司，批号181711151-。
12仪器旋涡混悬仪（海门其林贝尔，型号VORTEXE）j离心机（德国Bechmvx，型号Mic/fuyv 22R）、电子天平（上海浦春计量有限公司，型号JU2201-、实时定量PCR仪美国Theuno Scientific公司，型号7500）、酶标仪（澳大利亚Tecan公司，型号Infinilv220Pro）-Vox Frey纤维丝测痛仪（美国Dau-mle公司，型号Aesthesiv）。
2方法
22CIA造模方法牛I型胶原和弗氏不完全佐剂按照1:1混匀成乳剂。O0，将乳剂环绕多点注射于大鼠尾根部，每只注射乳剂0.1mL o07，将相同乳剂以同样方式注射于大鼠尾根部，每只注射0.1mL o
22实验分组与给药方法将32只Wktar雄鼠分组。除正常组（NC组）10只外，其余大鼠造模成功后又随机平均分成模型组（Model组）和给药组（DEX组）。05开始，给药组腹腔注射地塞米松1 my•ky-1，每周给药3次，连续给药4周。同时，正常组和模型组腹腔注射等体积生理盐水。
22疼痛行为学测试造模后，每周2次，在明亮、安静环境下，使用Vox-C/y测痛仪，通过up and down法⑷检测各组大鼠有后足机械性缩足反射阈值（mechanical withdrawal threshold,M W T-。先将每只大鼠置于底部为金属筛网的透明塑料笼内适应环境17mix，待其平静后，用Vox F/j纤维丝从笼底垂直刺激大鼠后足底中部位置。当大鼠出现快速缩足即视作阳性反应，若时间大于5S仍无缩足反应则视作阴性。每次间隔至少5mix，连续测3次，取平均值。根据Dixon公式计算50%缩足阈值。[50%缩足阈值=D（Xf+K）/17000] Xf为末次刺激纤维丝力度的对数值,k为不同刺激方式的系数, S为各刺激力度取对数值后相邻间距的平均数。
2.2ELISA法测定血清中炎症因子ILE7A和TGF-p1水平末次给药24h后，将大鼠麻醉后经腹主动脉取血。离心（3640a•min"1X D miu）后将血清冻存于-861。试剂与血清样本平衡至室温后，按照ELISA试剂盒说明书检测步骤操作。使用酶标仪进行450nm与632nm双波长检测，根据标准曲线计算样本OD值。
22Reel-time PCR检测滑膜炎症因子mRNA的表达情况剥离大鼠后肢膝关节周围皮毛、筋膜与肌肉，剪开韧带并剥离髌下脂肪垫，用眼科剪刀取出大鼠滑膜组织。研碎后，TRIzol法提RNA，并在PCR扩增仪逆转录成cDNA o PCR扩增程序：95七高温变性,66七低温退火并延伸，共40个循环, 65°C适温延伸J]o引物序列见Tab1。
22Reel-time PCR检测DRG相关炎症因子和疼痛指标NPY、NGF、BDNF、TRPV1的mRNA表达情况大鼠处死后，沿背部正中线剪开皮肤、分离脊柱侧边肌肉，咬骨钳或剪刀打开脊柱，分离脊髓后，在左右对称的椎间孔内可见淡黄透明卵状的DRG[4]o取出L-L6双侧DRG并研碎,TRIzol法提RNA，并在PCR扩增仪逆转录成cDNA o PCR扩增程序同2.5，引物序列见Tab1。
22统计学分析采用SPSS22.0软件对本实验数据进行统计学分析，实验结果用平均数±标准差（土s）表示。One-Way ANOVA对各组之间数据进行统计学差异分析。
3结果
32地塞米松对CIA大鼠MWT的影响造模初
十一五
Tab1Primer sequences in PCR
Gene Fouvard primes Base Reverse primes Base IPE05'-EGCAGCTTTCGACAGTGAGGE'215JPTCCACGGGCAAGACATAGGE'20 IP-2y-TTCTCCGCAAGAGACTTCCAG-5'21y-TTCTGACAGTGCATCATCGCT-5'21 IPE75ITCATCCATGTGCCTGATGCTE'20y-ETTATTGGCCTCGGCGTTTGE)20 TNF-o0-ETGGGCTCCCTCTCATCAGTE'205IGCTTGGTGGTTTGCTACGACE)20 TRPV1y-TTCACCGAATG
GGCCTATGG-5'20y-OGACGGTTAGGGGTCTCACTE'20 NPY y-ETGTTTGGGCATTCTGGCTG-5)20y-TTCAAGCCTTGTTCTGGGGGE'20 NGF y-TGCATCGCTCTCCTTCACAGA-5'21y-OACGCCGATCAAAAACGCTGE'20 BDNF y-ETCGCACGGTCCCCATTG-5'185'-ECCTGGTGGAACTCAGGGTE)D
中国药理学通报Chinese Pharmacological Bulletin2022Doe；33(16)-1693•
期,3组大鼠MWT没有明显差异。dl6-16，模型组MWT值呈快速下降趋势，随后一直维持在较低水平。dl6模型组MWT较正常组明显变小(P< 2.26)，而地塞米松组较模型组明显升高(P< 2.05)，见Fig6。
60r 00
80
o
o
6
4
##
*
40
20
D10D12D17D19D23D26D30
Time/Day
20o
o
60
工
NC
工Model DEX
T Ml
#
20(
Fio1MeyssremenS resdlSc of MWT of roh in exch grrup(c±e,n=16)
#P<0.01ee NC groun；*P<0.05ee model groun
3.2地塞米松对CIA大鼠血清中炎症因子含量的影响连续给药4周后，取血清，采用ELISA方法对0组大鼠的促炎因子IL-67A、抗炎因子TGF-p1表达量分别进行检测。模型组IL-J7A表达量明显高于正常组(P<2-26)，给药组IL-J7A表达量较模型组有明显降低(P<0.05)。模型组TGF-C6表达量明显低于常组(P<2.05)，给药组TGF-C6表达量较模型组有明显升高(P<0.41)o表明地塞米松可以降低CIF大鼠血清中促炎因子表达量，同时提高抑炎因子的表达量，具有整体抗炎功效。见Fig2。
3.3地塞米松对滑膜中炎症因子mRNA表达的影响从Fip0的Real-time PCR结果可见，相较正常组，模型组滑膜组织中的症因子ILC p、IL-6、、L-65、TNF a mRNA的相对表达量上升；给药组中这些炎症杨子烈
因子的相对表达量较模型组减少，差异均具有统计学意义。表明地塞米松具有抗炎作用，可以抑制滑膜中的炎症因子，减轻滑膜炎症。
3.4地塞米松对DRG中炎症因子mRNA表达的影响从Fig4A的Real-time PCR结果可见，相较正常组，模型组DRG中的症因子IL-J p、AT、IL-65、TNF a mRNA的相对表达量上升；给药组中这些炎症因子的相对表达量较模型组减少，差异均具有统计学意义。表明地塞米松可以抑制DRG中炎症因子，具有抗炎作用。
o
NC Model DEX Fio2Effect of dexamethasone on expression of IL-27A
and TGF-fU in serrmt c±e,n=3-
#P<6. 05,##P<0.01e$NCgrwn；*P<0.05,**P<0.01e model group
u
h
u
a
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U
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Q
J
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A
l
l
规律的特点
B
I
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a
5
4
3
2
1
NC
HUD TNF-a
口IL-邛
0IL-6
应IL-17
Fio3Effect of dexamethasone on inaammatoro foctors
in synovium(c±e,n=3-
#P<0.05,##P<0.01ee NC groun；*P<0.05ee model group
3・5地塞米松对DRG中疼痛相关指标的影响
从Fif4B、4C的ReS-Tmv PCR结果可见，相对于正常组，模型组DRG中的疼痛相关的神经生长因子：神经肽Y2depropeptida Y,NPY)、神经生长因子(nerve yrowth fuctvr,NGF-、脑源性神经营养因子2brain-2eriveC necrotrobkic factvr,BDNF-以及疼痛指标：瞬时感受器电位香草酸受体6(transieci
recep-
-1694 •
中国药理学通报 Chieese Pharmncologicnl Bulletin 2020 Dec ；33(17)
too potential venilWid-l , TRPV 1 -的 mRNA 的相对表 达量上升；而在给药组中NPY 、NGF 、BDNF 、TRPV1
的 mRNA 的相对表达量较模型组减少，差异均具有
统计学意义。表明地塞米松可以抑制DRG 中这些 疼痛相关的受体和神经生长因子的含量，具有缓解
疼痛的作用。
□ NPY 因NGF 应 BDNF
Model
DEX
NC C 4 r
#
3
2
1
试验设计与分析总 a
.g
l A d u u o
n o I s s a l d x Q
O A W I O M
工
0------------------------------------------------------------------------
NC
Model DEX
Fin 4 Effect of dexamethasone on mRNA expression of inOammatora foctrrs and pain indict t ors in DRG (( ± s , n - 3 )
A : Reammatom factors ；
B : Nerve growth factor ；
C : TRPV 1. #P <
0. 05 , ##P <0. 01 es NC group ； * P <0. 05, * * P <0. 01 es model g/xp
4 讨论
RA 是一类以滑膜炎为特征的自身免疫性疾
病，常出现手足小关节滑膜炎、关节肿痛。晚期还会
造成骨和软骨破坏、关节变形、疼痛加剧、劳动力丧 失J ］。CIR 和RA 相似，均会出现炎症因子介导的
组织损伤、滑膜炎症和关节疼痛变形。地塞米松是
一类强效糖皮质激素，具有抗炎、抑制免疫和稳定神 经膜的作用。临床常单独或联合其他镇痛药物用于 神经根病变、神经阻滞疼痛、神经炎性疼痛，术
后疼痛，甚至是中重度癌症疼痛^4。因此，本实验 通过建立CIR 大鼠模型，进一步研究DEX 对于缓解
CIR 局部炎症和关节疼痛的作用机制。
炎症因子在机体内的含量也与疾病严重程度紧
密相关。研究发现，炎症因子ICE P J C-6J CE7, TNF-o 在RA 患者体内大量存在，会造成滑膜炎、关 节软骨破坏和疼痛J]o 而TGF-pl 则具有炎症抑 制、免疫抑制作用和促进纤维细胞、成骨细胞增殖的 作用，在RA 中可以减少滑膜细胞增生、炎性细胞浸
润、血管增生和肉芽组织的形成，对防止滑膜增生、 浸润及关节破坏有重要作用J 2]o 局部注射TGF-pl
不仅能促使伤口愈合，还能促进骨和软骨的修复。
本实验通过ELISA 法测得大鼠血清中致炎因子IC-
17A 的含量明显高于正常组大鼠，而抗炎因子TGF-
0的含量则低于正常组大鼠。在DEX 后，给 药组血清内IC-17A 含量较模型组下降明显，TGF-
01含量明显回升。说明DEX 可以有效降低CIR 大
鼠血清内的炎症因子IC-17A ，提高TGF-C 1的作用, 具有抑制整体促炎因子、增加抗炎因子，进而减少机
体免疫应答、缓解局部滑膜炎症和增生的作用。
滑膜炎是RA 基本病理改变之一。早期控制滑
膜炎可以有效缓解病情，阻止关节破坏、僵硬变形, 还能减少残疾的发生。PCR 结果显示大鼠滑膜组 织中炎症因子 ICE p j C-6 J CE7.TNF-O 的 mRNA
表达水平均高于正常组；而给药组的炎症因子水平 较模型组均降低。说明地塞米松对膝关节滑膜组织
的局部炎症可以起到明显的缓解作用。
DRG 由脊髓神经节内的感觉神经元的轴突组
成，对称地连接于在脊髓背根左右两侧。它作为痛
觉传入神经元在疼痛调节机制中有非常重要的作 用，在神经病理性疼痛的机制研究中具有重要意义。 DRG 中的炎症因子参与疼痛的形成，还会导致疼痛
表达上调31-4] o 这些炎症因子不仅能引起急慢性 疼痛、触诱发痛，还与神经源性痛紧密相关。本实验
通过Real-tiov PCR 法检测大鼠DRG 中炎症因子
ILE 0、ILE 、ILE7、TNF-o 的 mRNA 的表达水平。结 果显示，模型组大鼠炎症因子mRNA 的表达量相较
正常组均有不同程度的升高，而给药组较模型组炎 症因子mRNA 的表达量均有降低。表明地塞米松
黑海番鸭可以降低DRG 中的炎症因子的表达，这可能也与给 药后痛阈的降低有关
。
中国药理学通报Chinese Pharmacological Bulletin2020Dec；33(12)-1677-
NPY是存在于外周和中枢神经元中的一类内源性物质，参与疼痛调制。研究表明，脊髓Y1受体的激活和DRGY2受体的拮抗都能达到缓解机械痛的作用[5]。神经生长因子NGF可影响外周和中枢神经病理性疼痛，且NGF在RA患者的滑膜中含量与关节痛敏程度有关。动物实验证实，经过抗NGF 后疼痛得到明显缓解J/]o BDNF作为一类脑源性神经营养因子，与中枢神经的发育分化以及神经病理性疼痛紧密相关。多种疼痛动物模型中发现，阻断BDNF可以有效抑制痛敏现象的发生[5]。TRPV1在三叉神经节和DRG中均有表达，可参与慢性的外周和中枢敏感化，也与急性炎症痛敏相关，在热痛敏和机械痛敏起重要作用少]。本实验通过ReW-tima PCR法检测大鼠DRG中神经生长因子NPY、NGF、BDNF和疼痛相关的额离子通道受体TRPV1的mRNA的表达水平。结果发现模型组大鼠的NPY、NGF
、BDNF、TRPV1的mRNA的表达量较正常组均有不同程度的升高，而给药组较模型组均有降低。说明地塞米松可以有效降低CIL大鼠DRG中NPY、NGF、BDNF、TRPV1的表达，对调节CIL中的疼痛反应有很好疗效。
综上，地塞米松CIL大鼠滑膜炎症和关节疼痛有明显的疗效。DEX可以降低CIL大鼠血清中促炎因子水平，同时提高促炎因子水平。此外，DEX还能通过改善滑膜内炎症因子和DRG中炎症因子、疼痛相关的神经生长因子NPY、NGF、BDNF 以及香草酸受体TRPV1的水平以达到减轻滑膜炎症和缓解关节疼痛的目的。
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(1.Dept op Phmmacp；2.Phmmacp Intraveonr AUmixturc Sepicer,Dept p Phmmacp,Shanghai Ninth People，s
Hosphai,Shanghai JiaoTong Ungersity School pMePiPm,Shanghai200411,ChOa)
Abstruct：Aim Ta sm/y tha effects of Uexamethot soxa ox pain in collagen inhuced arth/tis(CIA)uts.
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