应用与环境生物学报 2007,13(6):868~871
Chi n J App lEnvi ron B i o l =ISSN 1006-687X
2007-12-25
收稿日期:2006-11-21 接受日期:2007-02-12*国家自然科学基金(N o .30570142)、江苏省青年科技创新人才(学术带头人)基金(BK2006504)及及教育部长江学者和创新团队发展计划资助(I RT0532)资助 Supported by t he National Nat u ral S ci ence Foundati on of Ch i na (No .30570142),the You t h Scientific and Techno -l og i ca l Innovation Foundation of Ji angsu ,Ch i na and t h e P rogra m for C hangjiang Scholars and Innovati ve Res earch Tea m i n Un i versit y ofC h i na (I RT0532)
**通讯作者 Correspond i ng author (E -m ai :l raoz m@yahoo .co m.c n )
*
流行病学饶志明
1**
张君胜
1,2
沈微1 方慧英1 诸葛健
1
(1江南大学工业生物技术教育部重点实验室和工业微生物中心 江苏无锡 214036)
(2江苏畜牧兽医职业技术学院 江苏泰州 225300)
摘 要 通过构建质粒pCAM 3300-zeocin ，将其电击转化到根癌农杆菌LBA4404中.将含有目的质粒pC AM 3300-zeocin 的根癌农杆菌和工业化产甘油假丝酵母(Candi da glycerinogenes )W L2002-5共培养，利用z eoci n 抗性基因为筛选标记,
实现了pCAM 3300-z eoci n 对产甘油假丝酵母的转化.并根据产甘油假丝酵母的生长特性，对转化条件进行了优化，在共培养时间为24h ，产甘油假丝酵母和根癌农杆菌的细胞比例为1B (500~1000)时最高转化率达到2个转化子/104个酵母细胞.初步建立了根癌农杆菌介导转化产甘油假丝酵母的转化方法.图3表2参12关键词 产甘油假丝酵母；转化；根癌农杆菌;zeocin 基因CLC Q 75:TQ 923
Geneti c T ransfor m ation of Industrialized Strai n Cand i da g l yceri nogenes
by Agrobacteri u m t u m efaciens
*
RAO Zhim i n g
1**
,Z HANG Junsheng 1,2,SHEN W e i 1,FANG H u i y i n g 1&Z HUGE Jian
1
(1K e y L aboratory of Indu st rial B iot echnol ogy,M inistry of Educa ti on,R ese arc h Cen t er of Industri a lM i croorg an is m s ,
J i angnan Un iversit y ,W ux i214122,Jiangsu ,Ch i n a)
(2Ji ang s u A ni ma lH u sband ry and Ve t erina ry Colle g e ,T ai zhou 225300,J i angs u,C h i na)
Abstract In th i s resea rch ,the plas m id p CAM 3300-zeo cin was constructed and transf o r m ed i nto Agrobacter i um t umefaciens .
The A.t u m efaciens con tai n i ng t he b i nary vector pCAM 3300-z eoci n w as co -cultivated w ith i ndustrialized stra i n Cand i da g l y cero logenes is W L 2002-5.T hen ,transfor m ants w ere screened on a plate conta i n i ng 150m g /L Z eo ci n .PCR results demon -stra ted t hat zeocin gene w as i ntegrated i nto nuclear genom e of C.glycerologenesis .R esearch results i ndicated tha t z eoci n gene cou l d be utilized as se l ec ti on m arker and the Z eoc i n coul d be used as selecti on pressure i n transfo r ma ti on o f C.g l y cero logene -sis .A cco rd i ng to the gro w th charac teristi cs o f C .g l y cero logenesis ,t he transfor m ation conditi ons were furt her opti m ized .T he re -sults show ed t hat the transfor m ation e ffi c iency cou l d reach t w o trasfor m ants per 104C.gl y cero logenesis cellw hen cocu lti vation ti m e re m a i ned 24hours and cell rati o o f C.g l y cero logenes is and A.tu m efaciens w as 1B 500~1000.The successf u lly construc -ted transfor m ation sy stem of C.gly cerologenesis by A.tu m efaciens can prov i de a pow erful too l f o r f urther research o f foreign g enes expressi on i n C.glycerologenesis .F i g 3,T ab 2,R e f 12K eyword s Agrobacteriu m tu m efaciens ;Candida gl y cerinogenes ;genetic transfo r ma ti on ;zerci n g ene CLC Q 75:TQ 923
转化是酵母基因操作中的重要步骤之一.1978年H i n -nen [1]和B eggs [2]首次报道应用原生质体法将质粒成功转入酿酒酵母.目前广泛采用的酵母转化方法主要有原生质体转化法、醋酸锂转化法、电击转化法等，这些方法在酵母的遗传转化研究上已取得了巨大的成功[3].但是它们在转化工业化生产菌株产甘油假丝酵母时遇到了很大的困难.根癌农杆菌介导的遗传转化以其操作简单、转化率高、转基因低拷贝、易于得到稳定的转化子等特点，被广泛的应用于植物的基因转化.Bundo -ck 等[4]于1995年首次成功实现了根癌农杆菌介导酿酒酵母的遗传转化.
耐高渗产甘油假丝酵母(Cand i da g l y cerinog enes )W L 2002-5是江南大学工业微生物研究中心的科技工作者经过30余年的潜心研究获得的工业化生产甘油的优良菌株.产甘油假丝酵母除了具有甘油产率高、耐高渗、生长快、发酵原料简单等优点，还能产生多种其他多元醇，如赤藓醇、D -阿拉伯醇和甘露醇等，因此是一类应用价值极高的酵母[5].采用基因工程手段构建重组菌是进一步改进产甘油假丝酵母性能的重要途径，实现这一目标首先要获得有效的载体和转化方法，在此基础上才有可能对产甘油假丝酵母代谢途径进行有目的的改造，以达到提高甘油产量和改善工艺的目的.因此，建立产甘油假丝酵母的遗传转化体系具有重要意义.
常规的酵母转化方法转化产甘油假丝酵母未有成功报道.在作者成功建立根癌农杆菌转化酿酒酵母方法的基础上[6]，本研究尝试了采用根癌农杆菌转化产甘油假丝酵母的可行性;
并针对产甘油假丝酵母生长较快的特点结合本研究的转化方法对转化条件进行了适当的优化.
1材料与方法
1.1菌株和质粒
根癌农杆菌LBA4404含利福霉素及链霉素抗性为本研究室保藏，耐高渗产甘油假丝酵母W L2002-5为本研究室保藏.质粒pCAM3300，含卡那霉素抗性由中国水稻研究所馈赠. zeocin抗性基因由本研究室工作人员从质粒pP I CZB上克隆得到，质粒pP I CZB购自Inv itrogen公司.pEGM-T-easy vector试剂盒为P rom eg a公司产品.
1.2工具酶和试剂
实验中的各种酶、氨基酸营养因子和抗生素(头孢噻肟除外)均购自上海华美生物工程公司，头孢噻肟和乙酰丁香酮(A cetosyr i ngone,A S)购自Sig m a公司，抗生素Zeoc i n购自上海普飞生物科技有限公司，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自博大泰克,T r i s、CTAB、SDS购自S i gm a公司，其他化学试剂均为国产分析纯.
1.3培养基
LB培养基(Q/g L-1)：蛋白胨10100、酵母膏5100、氯化钠10100;Y PD培养基(Q/g L-1)：蛋白胨20100、酵母膏10100、葡萄糖20100;S M培养基(选择培养基)(Q/g L-1)：酵母氮基6170、葡萄糖2010
0;p H610.MM培养基(基本培养基)、I M 培养基(诱导培养基)见文献[7,8].
1.4根癌农杆菌的转化
将含有zeo cin基因的质粒pCAM3300-zeocin通过电击法转化到根癌农杆菌LBA4404中.在卡那霉素抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证.根癌农杆菌感受态的制备及转化方法见参考文献[7]，根癌农杆菌质粒提取方法见参考文献[9].
1.5根癌农杆菌T i质粒转化产甘油假丝酵母
根癌农杆菌T i质粒转化产甘油假丝酵母的方法参考文献[10]并有所改进.接种含有质粒pCAM3300-zeocin的根癌农杆菌LBA4404于LB培养基(卡那霉素50L g/mL，利福霉素50 L g/mL，链霉素30L g/mL)中,30e,200r/m i n摇床培养36 h，离心收集菌体，用等体积的I M培养基重悬，培养6h；接种产甘油假丝酵母于Y PD培养基中,30e,200r/m i n摇床培养
过夜；产甘油假丝酵母的Y PD培养液按1B5稀释到YPD新鲜培养基中，培养6h.分别离心收集产甘油假丝酵母和根癌农杆菌菌体，用生理盐水清洗一次，用I M培养基重悬菌体，产甘油假丝酵母细胞终浓度达到109个/mL，根癌农杆菌细胞终浓度达到1011个/mL，各取50L L加入20mL I M培养基(乙酰丁香酮200L m o l/L，卡那霉素50L g/mL，利福霉素50L g/mL)中30e,200r/m i n培养过夜.取200L L培养液涂
布到铺有玻璃纸的I M+A S固体培养基平板置于25e培养24h；将玻璃纸转接到S M培养基(头孢噻肟200L m o l/L,Zoec i n150m g/L)上培养2d，筛选阳性酵母转化子.
1.6产甘油假丝酵母阳性转化子表型验证
将筛选的阳性转化子和产甘油假丝酵母同时在S M培养基
(Z oeci n150m g/L)上划线30e培养24h后观察生长情况.1.7产甘油假丝酵母阳性转化子染体的提取及
PCR验证
经过初步筛选的产甘油假丝酵母阳性转化子进行染体提取和PCR验证.产甘油假丝酵母染体的提取参考参考文献[11].
根据z eoci n基因的特异性设计引物：引物F:5p-ATGGC-C AAGTTGA CCAGTGCCGTTC-3p；引物R:5p-GTCAGTCCT-GCT CCTCGGCCA CGAAG-3p.
用该对引物在特定条件下扩增产甘油假丝假丝酵母染体没有条带，扩增zeocin基因会得到大小为300bp的DNA片段.
酵母18S r DNA两端引物：引物F:5p-ACCGGAATTCG-GCAGGGACGTAATCAACG C-3p；引物R:5p-ACCGGAATTCGC-CTGAGAAA CGGCTA CCAC-3p.
最牛班规
PCR反应条件为:95e5m i n,94e变性50s,52e退火115m i n,72e延伸1m in，经过30个循环后,72e延伸10 m i n.PCR扩增产物用115%的琼脂糖凝胶电泳检测.
1.8产甘油假丝酵母转化子稳定性验证
将阳性转化子在YPD培养基斜面培养,24h后挑取菌落再次在YPD斜面培养基上划线培养.每转接一次定义为一代.转接10代以后挑取菌落接种于S M培养基(含Zoec i n150m g/ L)和YPD培养基对照实验，并提取染体PCR验证.
1.9转化条件优化策略
1.9.1I M固体培养基诱导共培养时间优化取培养过夜的I M培养液，适当稀释涂布I M固体培养基，共培养0、12、18、24、30、36、40h将玻璃纸平行转移到S M固体培养基进行筛选培养，观察S M平板上转化子的生长情况.同时对I M培养液进行酵母菌落计数，计算转化率.
1.9.2共培养根癌农杆菌菌体量优化取109个/mL的酵母细胞10L L，和1011个/mL的根癌农杆菌细胞1、10、50、100、200、500L L混匀共培养，筛选阳性转化子并计算转化率.
2结果与讨论
2.1质粒pC AM3300-zeocin的构建及酶切验证
apec质粒的构建如图1，分别提取质粒pCAM3300、T-zeocin，经过E co RÑ酶切，胶回收zeocin基因和线性pCAM3300；在T4
图1重组质粒pCA M3300-zeoc i n的构建
Fi g.1C onstru cti on of reco m b i nant p l as m i d pCAM3300-zeoci n
869
6期饶志明等：根癌农杆菌介导工业化产甘油假丝酵母的遗传转化
DNA 连接酶的作用下连接得到p CAM 3300-z eoci n .质粒p CAM 3300-zeocin 的酶切验证见图2，质粒p CAM 3300-z eoci n 经过Eco R Ñ酶切，切下了112kb 大小的片段，与预期的zeocin 基因大小一致，说明z eoci n 基因已成功地连入了载体pCAM 3300.
2.2 根癌农杆菌阳性转化子的获得
将在抗性平板上挑取的阳性根癌农杆菌转化子在液体LB 培养基(卡那霉素50L g /L )中培养24h 后提取质粒，将得到的质粒进行酶切验证(同图2未列出)，证明已得到了含有质粒pCAM 3300-zeocin 的根癌农杆菌
.
图2 质粒pCA M 3300-zeoc i n 酶切验证Fi g .2 En z y m ati c d i gesti on of pCAM 3300-zeoci n
1.T -zeocin /E co R Ñ;
2.DL2000;
< i n /E co R Ñ;
4.pCAM 3300/E c o R Ñ;
5.pCA M 3300-zeoci n /Eco R Ñ;
6.pCAM 3300-zeoci n /Bam H Ñ;
7.K DNA /H in d Ó
2.3 产甘油假丝酵母转化子的获得及初步鉴定
在I M 培养基上共培养1d ；然后转移到S M 培养基(头孢噻肟200L m o l/L )上培养1d ，已经可以看到中间长出许多的
酵母单菌落.挑取长势较好的酵母菌落，在S M 培养基上划线,30e 培养1d 后菌落生长良好的转化子可以初步确认为阳性转化子，转化子命名为Cand i da glycerinogenes-zeo cin (C .g -z).
在产甘油假丝酵母的转化研究中，发现由于产甘油假丝酵母生长迅速，在I M 平板上诱导培养达到36h 时候产甘油假丝酵母菌落就已经长满I M 平板，无法进行后期抗性转化子的选择工作，因此我们对I M 固体培养基最佳诱导共培养时间进行了研究.
2.4 产甘油假丝酵母转化子PCR 验证
将初步确认的产甘油假丝酵母阳性转化子接中于Y PD 液体培养基中,30e ,200r/m i n 培养18h ，提取染体进行PCR 鉴定，同时作阴性对照，琼脂糖凝胶电泳见图3.从图中可以看出，阳性转化子中可以扩增出zeocin 基因的特异性片断，而阴性对照染体中无法扩增出该特异性片段，但产甘油假丝酵母染体可以扩增得到18S rDNA 基因片段，说明产甘油假丝酵母的染体是可以用于扩增的.由于产甘油假丝酵母染体上不含有zeocin 基因，因此产甘油假丝酵母染体无法扩增出zeocin 基因，而阳性转化子可以扩增得到zeoci n 基因，说明转化子中已含有了z eoci n 基因.PCR 鉴定的结果初步表明通过
根癌农杆菌介导转化的方法已实现了zeocin 基因对产甘油假丝酵母转化.
图3 阳性转化子PCR 验证Fig .3 PCR results of positive trans f or m ants
2.DNA M arkerDL2000;3、4、5、6.阳性转化子zoe c i n 基因特异扩增;7.产甘油假丝酵母zoecin 基因特异扩增;8.产甘油假丝酵母18S r DNA 扩增1.Am p lified p roduct of zeoc i n gene ;2.DNA m ark er DL2000;3,4,5and 6.Amp lifi ed produ cts of positive trans f or m ants w ith p ri m ers of zeocin gene ;7.Amp lifi ed p roduct fro m geno m i c DNA of host strai n w it h pri m ers of zeoci n gene ;8.Am pli fi ed produ ct fro m geno m i c DNA ofh ost strai n w ith pri m ers of 18S r DNA
2.5 转化条件优化结果
在不同诱导共培养时间下产甘油假丝酵母的转化率见表1.从表1结果中可见，随着诱导时间的增加转化率也在增加.说明产甘油假丝酵母在根农杆菌介导的转化中，随着诱导时间的增加T i 质粒T-DNA 进入酵母细胞的几率增加.试验中发现，由于产甘油假丝酵母生长迅速，随着诱导共培养时间增加，当在I M 培养基上共培养达到30h 的时候产甘油假丝酵母就已经开始在玻璃纸上形成菌落，这时候再向S M 平板上转移玻璃纸，在S M 平板上转化子很难分辨，这对后期玻璃纸转移后的筛选增加了难度.而当共培养时间为36h 时在S M 培养基上则无法辨认转化子.因此应用这种筛选方法最佳的诱导共培养时间应该在18~24h 之间，不应超过24h .
表1 不同共培养时间对转化率的影响
T ab l e 1 E ffect o f cocu lti vation ti m e on transforma ti on effic i ency
共培养时间Coculti va ti on ti m e (t /h)
6
12
18
24人民日报七一社论
30
36
阳性转化子数P ositi ve tra nsf o r m a nts (n /103m L -1
)
15.0102.0310.0395.0452.0821.0无数
产甘油假丝酵母细胞浓度
Conce ntrat i o n of C.gl y cerino -genes cell (n /1093mL -1
)2.5
网络守护神转化率(转化子/105产甘油假丝酵母细胞) T rasfor m at i o n
effici ency (N o .o f tra nsf o r m a n t s /105C.g l yceri no g enes ce ll s)0.64.012.415.718.032.7
无数:Num erous
870 应用与环境生物学报 Chi n J App lEnvi ron B i o l 13卷
在不同的根癌农杆菌浓度下产甘油假丝酵母的转化率见表2.相同酵母细胞浓度下500~1000倍的根癌农杆菌细胞浓度为最佳，当农杆菌的浓度再增大时转化率并无明显提高，浓度减小时转化率会降低.这与我们前期酿酒酵母转化研究中1B100的比例不同，可能是因为产甘油假丝酵母分裂增殖比较快，在产甘油假丝酵母细胞分裂前周围需要有更多的根癌农杆菌，增加他们的结合效率来提高T-DNA转入产甘油假丝酵母的几率.
表2根癌农杆菌浓度对转化率的影响
T ab l e2E ffect o f A.tu m efaciens ce lls p concentration
on transfor m ation e ffi c iency
加入根癌农杆菌菌体量
Am ounts of C.g l yce rinogenes
cell s added(V/L L)
11050100200500
阳性转化子个数
Pos i ti ve transfor m an ts
(n/103mL-1)
536296352361343
产甘油假丝酵母细胞数
No.of C.g l yceri n o g enes
cell(n/109mL-1)
1.51.6
2.02.21.71.8
转化率(转化子/106产
甘油假丝酵母细胞)
Transfor m ati on effici enc y(No.of
t rans for m a nts/106C.gl yc eri no ge nes cel ls)
3.022.2147.2163208.7188.5
2.6转化子稳定性鉴定
将转接了10代的转化子和原始菌株同在S M培养基(含Zeoc i n150mg/L)和Y PD培养基划线30e培养对
照培养，在d1观察发现，转化子在两种培养基上均生长良好，原始菌株则无法在S M培养基上生长.提取染体PCR验证，转化子依然可以扩增到zeoc i n特异条带.这些结果初步表明，产甘油假丝酵母阳性转化子特性可以稳定遗传.
3讨论
本研究通过将含有目的质粒pC AM3300-zeocin的根癌农杆菌LBA4404和产甘油假丝酵母共培养，利用zeocin抗性基因为筛选标记，得到了阳性转化子菌株.根据zeo cin基因序列特异性设计引物，利用该引物进行了PCR验证，在产甘油假丝酵母染体中无法扩增出目标产物，而在阳性转化子染体中可以扩增得到目标产物，初步证明z eoci n基因已经成功地转入了产甘油假丝酵母染体.表型验证结果也说明zeocin基因已经转入了产甘油假丝酵母.以上结果表明，已初步成功建立了根癌农杆菌介导转化产甘油假丝酵母的方法.研究中还根据根癌农杆菌的生长特性，对转化诱导共培养时间以及酵母细胞和农杆菌细胞比例进行了优化，发现最佳共培养时间为24h，最佳细胞比例为1B500~1000，最高转化率达到2个转化子/104个酵母细胞.
根癌农杆菌转化系统具有操作简单(不需要制备原生质体)、转化效率高、易于得到转化子、转化子遗传稳定等优良的特点[12].本研究成功建立了根癌农杆菌介导转化产甘油假丝酵母的方法，为开展相关产甘油假丝酵母的分子生物学研究，尤其是为将外源基因导入工业化产甘油假丝酵母进行表达提供了
有力的工具.目前我们正在进一步采用根癌农杆菌转化法将酵母甘油合成的关键酶基因导入产甘油假丝酵母基因组中，相关结果将另文发表.
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871
6期饶志明等：根癌农杆菌介导工业化产甘油假丝酵母的遗传转化
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