重组结核杆菌rCFP10-ESAT6融合抗原基因在HIV感染者中的特异性T细胞反应

张斌;伦文辉;李兴旺;成军;赵龙风;韩宁;王琦;向天新;毛羽

【摘要】目的检测人类免疫缺陷病毒(HIV)感染患者的结核(TB)特异性T细胞反应,为艾滋病合并结核杆菌感染诊断方法的建立提供理论依据.方法应用融合PCR和基凶重组技术,重组并表达结核杆菌蛋白rCFP10-ESAT6抗原蛋白,按照HIV感染和是否伴发结核病将实验对象分为健康对照组(14例)、TB组(7例)、HIV(+)/TB组(14例)及HIV(+)组(72例),以合成的rCFP10-ESAT6蛋白作为抗原,通过酶联免疫斑点技术(ELISPOT)分别检测四组患者外周血的特异性T细胞反应,并对HIV(+)患者相关检测结果及其CD4~+ 计数进行相关性分析.结果重组合成28kD的rCFP10-ESAT6融合蛋白,以此蛋白作为抗原通过ELIS-POT方法检测,在TB组和HIV(+)/TB组中阳性率达到100%,在健康对照组中为7.1%(1/14),在HIV(+)组为20.8%(15/72).TB组阳性率明显高于HIV(+)组以及健康对照组(P＜0.05),HIV(+)组阳性率亦明显高于健康对照组(P＜0.05).HIV感染者可能存在较高比例的潜在结核杆菌感染.相关性分析结果表明ELISPOT检测结果与HIV感染者的CD4~+计数之间没有相关性(r=-0.093,P=0.442;r=-0.083,P=0.13).结论 rCFP10-ESAT6融合蛋白可作为抗原利用ELISPOT方法对HIV合并结核感染进行检测,在HIV合并活动性结核患者,其检测结果与临床表现高度一致.

谭纶

【期刊名称】日灸《解放军医学杂志》

蛇咬伤病人的护理【年(卷),期】2010(035)001

【总页数】3页(P71-73)

【关键词】分枝杆菌;结核;HIV;T淋巴细胞

【作者】张斌;伦文辉;李兴旺;成军;赵龙风;韩宁;王琦;向天新;毛羽

【作者单位】100015,北京,北京地坛医院感染中心、首都医科大学传染病研究所;100015,北京,北京地坛医院感染中心、首都医科大学传染病研究所;100015,北京,北京地坛医院感染中心、首都医科大学传染病研究所;100015,北京,北京地坛医院感染中心、首都医科大学传染病研究所;山两医科大学第一医院感染科;100015,北京,北京地坛医院感染中心、首都医科大学传染病研究所;100015,北京,北京地坛医院感染中心、首都医科大学传染病研究所;100015,北京,北京地坛医院感染中心、首都医科大学传染病研究所;100015,北京,北京地坛医院感染中心、首都医科大学传染病研究所

【正文语种】中文

【中图分类】R512.91;R52

人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者及获得性免疫综合征(AIDS)患者由于存在免疫缺陷而成为结核杆菌的易感人。结核杆菌早期分泌抗原靶分子(early secretory antigenic target,ESAT-6)和培养滤液蛋白10(culture filtrate protein 10,CFP-10)可致感染者记忆效应T细胞增殖及IFN-γ早期大量产生。利用分泌INF-γ的重组融合蛋白的抗原特异性T淋巴细胞检测,可以对潜在的结核感染进行诊断,且不受外周血CD4+T淋巴细胞数量的影响。本研究通过重组表达结核分枝杆菌rCFP10-ESAT 6融合基因,获得纯化的结核杆菌特异性融合蛋白,并将此蛋白作为抗原检测HIV感染者全血中的特异性T细胞反应,以探索HIV合并结核感染的实验室诊断方法。

前列腺素e21 资料与方法

1.1 研究对象及分组参照HIV临床诊断标准,选择2007年9月-2008年2月北京地坛医院性病艾滋病中心门诊及病房符合研究条件的HIV感染者86例,另纳入HIV阴性的结核病患者7例和健康志愿者14例。按照HIV感染和结核患病情况将上述人分为4组:健康对照组[n=14,年龄33±10(20～49)岁,无结核暴露史且结核菌素纯蛋白衍化物试验(PPD)阴性];TB组[n=7,年龄5

8±15(36～70)岁,确诊结核感染,符合结核感染诊断标准即抗酸染阳性或结核杆菌培养阳性];HIV(+)组[n=72,年龄36±15(22～84)岁,HIV感染且无合并结核杆菌感染];HIV(+)/TB组[n=14,年龄37±14(26～49)岁,HIV感染且合并结核感染]。

1.2 主要试剂结核分枝杆菌全基因组由北京市胸科医院张宗德教授惠赠;大肠埃希菌DH5α、BL21为本室保存;抗-His单克隆抗体购自Santa Cruz公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自NEB公司;淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque购自Pharmacia公司;酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immuno-spot,ELISPOT)试剂盒、BCIP/NBT购自Diaclone公司;化学发光底物购自Pierce公司;ELISPOT斑点自动计数仪购自CTL公司。引物合成及DNA测序由北京奥科生物公司完成。

1.3 方法

1.3.1 重组表达载体的构建及重组蛋白的表达根据GenBank中的基因序列,设计2对寡聚核苷酸引物(P1:5′-CCGG ATCCATGGCAGAGATGAAGAC-3′;P2:5′-GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCGAAGCCCATTTGCGAGGACAGCGCCT-3′;P3:5′-GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCATGA

CAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGG-3′;P4:5′-CCAAG CTTCTATGCGAACATCCCAGTGA-3′)。P1、P4两端分别引入BamHⅠ/HindⅢ酶切位点(粗体部分),P2、P3中设计互补的45个碱基对(划线部分)。将BamHⅠ/HindⅢ酶切后的目的基因片段与pET-28a(+)表达质粒连接,转化大肠埃希菌BL21,并测序验证。获得的重组蛋白以抗-His单克隆抗体和确诊结核患者血清作为第一抗体分别进行Western blotting检测(以健康对照组血清适当稀释作为阴性对照),证实是否为目的蛋白。以IPTG诱导表达rCFP10-ESAT 6融合蛋白,将诱导菌超声破碎,离心,取上清液过滤,用蛋白纯化仪纯化。用洗脱液洗脱吸附在Ni-NTA 树脂上的蛋白质,收集单峰,SDS-PAGE检测蛋白纯度。以10kD蛋白浓缩柱浓缩蛋白并用PBS置换缓冲液,用BCA法测定蛋白浓度[1]。

1.3.2 ELISPOT-IFN-γ分析采集 HIV(+)组、HIV(+)/TB组、TB组和健康对照组的外周血5ml,以肝素抗凝,用PBS等倍稀释,采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从全血中分离外周血单个核细胞(peripheral blood monouclear cells,PBMCs),用RPMI 1640完全培养液稀释至浓度为 2×105/100μ l的PBMCs混悬液。ELISPOT-IFN-γ步骤严格按试剂盒说明书进行。设实验组、空白对照组、阴性对照组及阳性对照组。实验组:以IFN-γ抗体包被96孔板,4℃过夜;PBS洗3次,脱脂牛奶室温封闭2h(100μ l/孔);加入 PBMCs(2×105/孔)及重组蛋白rCFP10-

ESAT 6(抗原刺激物,浓度50μ g/孔)。空白对照组不加入PBMCs及刺激物。阴性对照组加入等量PBMCs,不加刺激物。阳性对照组加入100μ l ConA(50μ g/ml)。于 CO2孵箱孵育18～20h,弃去PBMCs或刺激物,用PBST洗3次,加入100μ l检测抗体和 10μ l SAP,100μ l BCIP/NBT 显 ;于ELISPOT斑点自动计数仪上计数斑点,每一个斑点代表一个特异分泌IFN-γ的细胞。以斑点形成单位(spot forming unite,SFU)记录结果。SFU=(实验组斑点平均数-阴性对照组斑点平均数)/每孔细胞数×10。将4组病例ELISPOT检测结果所得斑点数统一换算为1×106个PBMCs中的SFU,以中位数表示。

1.3.3 HIV患者ELISPOT-IFN-γ检测结果与CD4+计数的相关性检测HIV(+)组与HIV(+)/TB组患者的CD4+计数,并与ELISPOT-IFN-γ检测结果进行相关性分析。

1.4 统计学处理采用SPSS11.5软件进行统计学分析,各组ELISPOT-IFN-γ斑点数据用中位数M(Q1,Q3)表示,斑点数大于50SFU/106PBMCs为阳性[2]。计算各组结核杆菌重组抗原-rCFP10-ESAT 6特异性ELISPOT反应的阳性率,用 χ2检验分析不同组别之间阳性率的差异,单因素相关性分析用于评价CD4+细胞计数对HIV感染者ELISPOT反应检测结果的影响。P＜0.05示差异有统计学意义。

皮皮鲁总动员在线阅读2 结果

2.1 rCFP10-ESAT 6重组蛋白的表达与纯化 PCR扩增获得649bp的预期片段,成功构建重组表达载体pET-28a(+)-rCFP10-ESAT 6。Western blotting检测结果显示获得了大小为28kD的重组蛋白,与预测蛋白大小相符(图1)。1mmol/L IPTG 37℃下诱导2h获得最大蛋白表达量。SDS-PAGE检测表明诱导蛋白纯度大于90%,BCA法测得的重组蛋白浓度为22.34mg/L。

2.2 ELISPOT检测结果分析健康对照组为27(18～42)SFU/106PBMCs;TB组为458(357～493)SFU/106PBMCs;HIV(+)组为 17(5～46)SFU/106 PBMCs;HIV(+)/TB组为167(72～247)SFU/106PBMCs(图2)。以50SFU/106PBMCs为阳性标准,TB、HIV(+)/TB组阳性率均为100%(分别为7/7,14/14);健康对照组阳性率为7.1%(1/14);HIV(+)组阳性率为20.8%(15/72)。HIV(+)/TB组阳性率明显高于HIV(+)组(P＜0.05);健康对照组与HIV(+)组之间的阳性率也有显著差异(P＜0.05)。HIV(+)组有1例痰培养为鸟分枝杆菌感染,但其检测结果为阴性(SFU/106PBMCs=10)。

2.3 ELISPOT检测结果与CD4+计数的相关性 HIV(+)组CD4+计数分布:≤200/μ l 25 人,200

～ 400/μ l 32人,≥400/μ l 15人;HIV(+)/TB 组 CD4+计数分布:≤200/μ l 9人,200～400/μ l 4人,≥400/μ l 1人。两组SFU与CD4+计数之间均无相关性(r=-0.093,P=0.442;r=-0.083,P=0.13)。