肝细胞癌组织中miR -548c -3p 、TRIM59的表达变化及其意义 人民解放战争是什么时间熊香芸1，2
，李茂山3，彭雁忠4
1深圳市龙华区人民医院，广东深圳518109；2广州医科大学；3广州金域医学检验中心有限公司；4北京大学深圳医院
摘要：目的分析肝细胞癌（HCC ）组织中微小RNA 548c -3p （miR -548c -3p ）、三基序蛋白59（TRIM59）mRNA 的表达及意义。方法
运用实时荧光定量PCR 检测114例HCC 组织及癌旁组织中的miR -548c -3p 、TRIM59mRNA ；分析miR -548c -3p 、TRIM59mRNA 表达与患者临床病理特征的关系；随访5年，采用Kaplan -Meier 法分析不同miR -548c -3p 、TRIM59mRNA 表达患者的生存差异。结果 HCC 组织中miR -548c -3p 的相对表达量低于癌旁组织，而TRIM59mRNA
表达高于癌旁组织（P 均<0.05）。HCC 组织中miR -548c -3p 、TRIM59mRNA 表达与TNM 分期、淋巴结转移和分化程度有
关（P 均<0.05）。HCC 组织中miR -548c -3p 与TRIM59mRNA 表达呈负相关（r =-0.735，P <0.05）。Kaplan -Meier 生存分析结果显示，miR -548c -3p 低表达者5年总体生存率（OS ）低于miR -548c -3p 高表达者；TRIM59mRNA 高表达者OS 低于TRIM59低表达者（P 均<0.05）。结论
HCC 组织中miR -548c -3p 表达降低，TRIM59mRNA 表达升高，两者与TNM 分
期、淋巴结转移、分化程度及预后有关，有可能成为新的HCC 诊治及预后的分子标志物。
关键词：肝细胞癌；微小RNA 548c -3p ；三基序蛋白59mRNA ；预后doi ：10.3969／j.issn.1002-266X.2021.01.003中图分类号：R735.7
文献标志码：A
文章编号：1002-266X （2021）01-0011-05
Expression change and significance of miR -548c -3p and TRIM59in hepatocellular carcinoma tissues XIONG Xiangyun 1，LI Maoshan ，PENG Yanzhong
1Longhua District People's Hospital ，Shenzhen 518109，China
Abstract ：Objective
To analyze the expression changes of microRNA 548c -3p （miR -548c -3p ）and tripartite motif
protein 59mRNA （TRIM59mRNA ）in the hepatocellular carcinoma （HCC ）tissues and their significance.Methods The expression levels of miR -548c -3p and TRIM59mRNA in 114HCC tissues and adjacent tissues were detected by fluo⁃
rescence real -time quantitative PCR （qRT -PCR ）；the relationship between miR -548c -3p and TRIM59mRNA expression and clinicopathological characteristics was analyzed ；they were followed up for 5years ，and Kaplan -Meier survival analysis was used to analyze the survival difference between patients with different miR -548c -3p and TRIM59mRNA expression.Results
The relative expression of miR -548c -3p in HCC tissues was lower than that in the adjacent tissues ，while the ex⁃
pression of TRIM59mRNA was higher than that in the adjacent tissues （both P <0.05）.The expression levels of miR -548c -3p and TRIM59mRNA in HCC tissues were related to TNM stage ，lymph node metastasis ，and degree of differentia⁃tion （all P <0.05）.There was a negative correlation between miR -548c -3p and TRIM59mRNA expression in HCC tissues
（r =-0.735，P <0.05）.Kaplan -Meier survival analysis showed that the 5-year overall survival （OS ）of patients with low ex⁃pression of miR -548c -3p was lower than that of patients with high expression of miR -548c -3p ；the OS of patients with high expression of TRIM59mRNA was lower than that of patients with low TRIM59mRNA expression （all P <0.05）.Conclu⁃sion
The expression of miR -548c -3p decreases ，the expression of TRIM59mRNA increases in HCC tissues ，and both of
them are related to TNM stage ，lymph node metastasis ，differentiated degree and prognosis ，which may become new molec⁃ular markers for the diagnosis ，treatment ，and prognosis of HCC.
Key words ：hepatocellular carcinoma ；microRNA 548c -3p ；tripartite motif protein 59mRNA ；prognosis
基金项目：广东省自然科学基金项目（2017A030310617）。
第一作者简介：熊香芸（1990-），女，主治医生，硕士研究生，主要从事临床全科医学相关研究。E -mail ：twinsbboy@163 通信作者简介：彭雁忠（1959-），男，主任医师，硕士研究生，主要从事病毒性感染防治研究。E -mail ：yanzhong_10@163
开放科学（资源服务）
标识码（OSID ）
11
t5003肝癌是成年人常见的癌症之一，占中国恶性肿瘤发病率的五分之一［1］，2018年全球新发肝癌病例 84万例，肝癌死亡78万例［2］。原发性肝癌中75%~ 85%为肝细胞癌（HCC）［1］。导致HCC发生的主要病因有乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎的慢性感染，长期大量饮酒及各种原因导致的慢性肝硬化［2］。HCC易出现肝内、外转移，且术后复发率较高。尽管近期对HCC分子机制的理解和方法取得了进展，但是目前仍迫切需要新的诊断或预后生物学标志物和靶点。miRNA是指长度为19~25个核苷酸的单链RNA分子，不具有编码蛋白能力［3］。近年来的研究证实，miRNA在肿瘤的发生发展过程起重要作用。微小RNA548c-3p（miR-548c-3p）是miR-548c家族中的一员，长度为22个核苷酸。miR-548c-3p在骨肉瘤［4］、乳腺癌［5］中表达下调，过表达miR-548c-3p可抑制骨肉瘤、乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。三基序蛋白59（TRIM59）属于三基序家族，该蛋白在卵巢癌、胆管细胞癌等组织和细胞中异常表达［6］。在卵巢癌相关的研究中，WANG等［6］证实TRIM59可以通过促进蛋白膜联蛋白A2（ANXA2）的表达从而促进卵巢癌的进展。SHEN 等［7］证实，TRIM59可通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制胆管细胞癌细胞的增殖能力。已有研究证实miR-548c-3
p可通过调控TRIM59mRNA表达促进HCC细胞增殖和侵袭能力［8］，但仍未有两者在HCC组织中的表达情况及其与患者临床病理特征及预后关系的研究。本研究分析了HCC肿瘤组织中miR-548c-3p、TRIM59mRNA的表达及意义，以期为寻新的HCC诊治及预后的分子标志物提供方向。
1资料与方法
1.1临床资料收集2013年1月—2015年1月于深圳市龙华区人民医院诊治的114例行手术的HCC患者的临床病理资料。纳入标准：经术后病理学检查确诊为HCC；初次发现，既往未接受过放化疗等抗肿瘤；患者或其家属均签署知情同意书，术后病理及随访资料完整无缺。排除标准：既往患有其他恶性肿瘤；合并严重心肝肾等脏器功能不全；合并感染性疾病、自身免疫性疾病等。其中男75例，女39例；年龄23～78（60.1±3.3）岁；肿瘤直径≤5cm者47例，>5cm者67例；淋巴结转移者49例；伴乙肝感染者56例；伴肝硬化者43例；肿瘤TNM分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期40例，Ⅲ期35例；分化程度：高分化32，中分化43例，低分化39例。以患者出院日为随访起始时间，利用电话随访，结合患者复查病历。随访截止于2020年1月，随访间隔时间1个月。随访内容为随访期间患者生存情况。
1.2组织中miR-548c-3p、TRIM59mRNA表达检测采用实时荧光定量PCR法。收集术中切除的新鲜HCC组织和距离4cm以上癌旁组织，经快速液氮冷冻运输，于-80℃深低温冰箱保存。将50mg组织冰上研磨后按照TRIzol说明书，提取组织RNA。按照逆转录试剂盒说明合成cDNA，采用分光光度计鉴定cDNA纯度，使A260/A280在1.8～
2.0，置于-20℃冰箱储存。TRIzol试剂及逆转录试剂盒均购于Invitrogen 公司。PCR纯化试剂盒、SYBR®Premix Ex Taq TM购于TaKaRa公司。miR-548c-3p上游引物序列：5'-TGGT⁃GTCGTGGAGTCG-3'，下游引物序列：5'-GGTG⁃CATTGTAGTTGCA-3'；TRIM59mRNA上游引物序列：5'-CTTCCGCCACTTGCCAATG-3'，下游引物序列：5'-TGGATCTCCCCTACTCGGTG-3'；内参基因U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCA-3′，下游引物序列5′-AACGCTTCACGA-3′；GAPDH上游引物序列：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTTC-3'，下游引物序列：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反应体系：SYBR mix2.5µL、上游引物（10µmol/mL）0.1µL、下游引物（10µmol/mL）0.1µL、cDNA1.00µL、去核糖核酸酶水1.3µL。反应条件：95℃、30s，95℃、15s，60℃、1min，42个循环。以2-ΔΔCt法计算miR-548c-3p、TRIM59mRNA的相对表达量。每个实验均重复3次以上。
1.3统计学方法采用SPSS2
2.0统计软件。计量资料以-x±s表示，两组比较采用两独立样本t检验；采用Pearson相关性分析分析miR-548c-3p与TRIM59的关系；采用Kaplan-Meier法分析不同miR-548c-3p、TRIM59表达患者的生存差异。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1HCC组织与癌旁组织中miR-548c-3p、TRIM59表达比较miR-548c-3p在HCC组织、癌旁组织中的相对表达量分别为0.503±0.141、0.890±0.076，两者相比差异有统计学意义（t=25.796，P< 0.05）。TRIM59mRNA在HCC组织、癌旁组织中的相对表达量分别为2.893±0.329、1.203±0.226，两者相比差异有统计学意义（t=45.207，P<0.05）。Pearson相关分析结果提示，HCC组织中miR-548c-3p表达与TRIM59mRNA表达呈负相关（r=-0.735，P<0.05）。
2.2HCC组织中miR-548c-3p、TRIM59mRNA的表达与患者临床病理特征的关系HCC组织中
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miR-548c-3p及TRIM59mRNA表达与TNM分期、淋巴结转移和分化程度有关（P均<0.05），而与患者性别、年龄、肿瘤直径、是否患有乙肝及是否存在肝硬化无关（P均>0.05）。见表1。
2.3HCC组织中miR-548c-3p、TRIM59mRNA表达与患者生存预后的关系本研究114例HCC患者中，随访2～60（38.2±6.3）月，随访期间死亡79例，无失访病例。以HCC组织中miR-548c-3p mRNA相对表达量均数0.503为临界值，分为高表达56例、低表达58例。高miR-548c-3p表达者随访4～60月，5年总体生存率（OS）为42.86%（24/56），生存时间为（38.5±6.7）月。低miR-548c-3p表达者随访2～60月，5年OS为18.97%（11/58），生存时间为（29.1±5.9）月。Kaplan-Meier分析（Log-rank检验）表明，低miR-548c-3p表达者5年OS低于高miR-548c-3p表达者（χ2=7.644，P<0.05）。低miR-5
48c-3p表达者生存时间低于高miR-548c-3p表达者（t=7.957，P< 0.05）。见图1。
TRIM59mRNA相对表达量以均数2.893为临界值，分为高表达55例和低表达59例。低TRIM59表达者随访3～60月，5年OS为42.37%（25/59），生
存时间为（42.1±6.2）月。高TRIM59表达者随访2～60月，5年OS为18.18%（10/55），生存时间为（31.1±5.9）月。Kaplan-Meier分析（Log-rank检验）表明，低TRIM59表达者5年OS高于高TRIM59表达者（χ2=7.830，P<0.05），低TRIM59表达者生存时间高于高TRIM59表达者（t=9.689，P<0.05）。见图2。
3讨论
肝癌是我国成人最常见的癌症之一，已经成为我国恶性肿瘤致死的重要因素之一［1-2］。肝癌转移率高，术后复发率高。早期的肝癌因缺乏临床症状，原发性肝癌在确诊时，多数已处于中、晚期，可接受手术的患者为5%~10%［1］。尽管现在对HCC的手段有所进展，如肝切除术、肝移植术、肝动脉栓塞化疗等，但肝癌的5年中位生存率仍保持在50%左右（17%~69%）［2］。到目前为止，关于肝癌转移和复发的分子生物学机制仍然处于探索阶段，因
表1HCC组织中miR-548c-3p、TRIM59mRNA表达与患者临床病理特征的关系（-x±s）
临床病理参数
年龄
<60岁≥60岁性别
男
女
肿瘤直径≤5cm >5cm
乙肝
有
无
淋巴结转移有
无
肝硬化
有
无TNM分期Ι、Ⅱ期Ⅲ期
分化程度
高中分化低分化n
59
55
75
39
47
67
56
58
49
65
43
71
79
35
易燃液体
75
39
miR-548c-3p
相对表达量（
-x±s）
0.512±0.140
0.493±0.172
0.525±0.139
0.483±0.143
0.494±0.145
0.506±0.134
0.517±0.146
0.492±0.141
0.107±0.148
1.028±0.132
0.471±0.148
0.506±0.165
0.535±0.146
0.431±0.132
0.551±0.166
0.411±0.113
t
0.649
1.516
0.455
白介素1
0.930
35.002
1.140
3.610
4.724
P
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
<0.01
>0.05
<0.01
<0.01
TRIM59mRNA
相对表达量（
-x±s）
2.944±0.353
2.838±0.363
2.703±0.345
2.645±0.324
2.833±0.322
2.935±0.353
2.937±0.326
3.043±0.339
4.146±0.319
1.231±0.309
3.065±0.314
2.989±0.323
1.978±0.298
4.961±0.319
1.953±0.293
4.701±0.387
地震与海啸的关系
t
1.580
0.869
1.574
1.701
49.175
1.230
48.242
42.447
P
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
<0.01
>0.05
<0.01
<0.01
13
此探索肝癌进展过程的分子机制，合理利用生物标记物以评估复发和转移的风险，将为进一步的提供方向和依据。
miRNA是一种非编码RNA，参与转录后调控下游基因的表达。miRNA通过特异性结合靶基因mRNA的3'非编码区来调控下游多种基因的表达。miRNA的表达和功能失常与炎症、免疫及肿瘤等有关。研究
表明，肿瘤中miRNA异常表达影响肿瘤的增殖、迁移及浸润等生物学行为，有可能成为肿瘤诊断、及随访的分子标志物［3］。miR-548家族最早发现可与多种病毒密切结合，如乙肝病毒、丙肝病毒和人类免疫缺陷病毒等，随后的研究证实miR-548与多种肿瘤均有关系。近年来多项研究发现，miR-548c-3p可参与调节多种肿瘤的发生发展过程，通过调控下游不同基因的表达，发挥抑癌基因的作用［9］。例如miR-548c-3p可通过抑制人低氧诱导因子1α（HIF-1α）介导的血管内皮生长因子（VEGF）信号通路抑制甲状腺癌的进展［10］。本研究中，HCC组织中
miR-548c-3p的相对表达量显著低于癌旁组织，其机制可能与调控miR-548c-3p基因表达的长链非编码RNA表达异常有关。研究表明，长链非编码RNA HIF1A-AS2能够作为分子海绵结合并抑制miR-548c-3p的表达，激活HIF-1α/VEGF途径，促进肿瘤细胞增殖、浸润等恶性生物学行为［11］。另外，本研究结合患者的临床病理特征数据发现HCC组织中miR-548c-3p的表达与TNM分期、淋巴结转移和分化程度有关，表明miR-548c-3p参与促进肝癌的恶性进展。分析其原因，可能是miR-548c-3p的表达下调激活VEGF的表达，VEGF能够促进肿瘤的血管及淋巴管生成能力，导致肿瘤细胞通过血管或淋巴管发生转移。此外，miR-548c-3p表达降低促进上皮间质转化过程中的间质性表型的表达增加，如N-钙黏素及波形蛋白的表达增加，促进肿瘤的恶性分化，导致肿瘤分化程度降低及分级增加［12］。Kaplan-Meier 分析发现低miR-548c-3p表达者5年OS低于高miR-548c-3p表达者，进一步证明miR-548c-3p的低表达可能与患者的预后不良相关，可作为HCC患者不良预后的生物学标志。
TRIM家族大多都拥有E3泛素化连接酶活性，TRIM59是TRIM家族成员之一，其编码基因位于3号染体上，编码的蛋白全长403个氨基酸，可通过调节p53抑癌基因和AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）信号通路及原癌基因的转录激活，在肿瘤细胞代谢、增殖、转移方面发挥重要作用［13-14］。本研究中，HCC 组织中TRIM59的mRNA表达高于癌旁组织，其机制可能是，肿瘤微环境中转化生长因子β通过激活下游Smad2/3信号的传导，导致下游TRIM59基因表达增加［15］。癌组织中TRIM59mRNA的表达与TNM 分期、淋巴结转移和分化程度有关，说明TRIM59参与癌变进展。TRIM59参与调节p53和AMPK的信号转导能力，TRIM59的表达上调可激活p53和AMPK信号通路，同时还可以促进原癌基因的激活，即从多途径调节肿瘤细胞的增殖及转移能力。CHEN等［16］发现TRIM59的表达可激活Wnt/beta-catenin经典通路，促进肿瘤上皮间质转化相关基因的表达，降低肿瘤分化程度，同时增强肿瘤细胞的增殖及转移能力，使肿瘤易发生转移。Kaplan-Meier 分析发现高TRIM59表达者5年OS低于低TRIM59表达者，结果提示TRIM59可作为判断HCC预后的标志物。
Pearson相关分析发现，HCC组织中miR-548c -
图2HCC组织中TRIM59mRNA表达与患者生存预后的关系图1HCC组织中miR-548c-3p表达与患者生存预后的关系14
3p与TRIM59表达呈负相关，这可能是因为TRIM59是miR-548c-3p的下游调控元件，即miR-548c-3p
可抑制TRIM59的表达，从而抑制p53/AMPK轴的促癌效应［8］。当癌组织miR-548c-3p的表达降低时，miR-548c-3p无法促进TRIM59泛素化并导致TRIM59的降解能力下降，因此TRIM59促进HCC细胞的促增殖及迁移能力。武汉科技大学外语外事职业学院
综上所述，HCC组织中miR-548c-3p表达降低，TRIM59mRNA表达升高，两者表达呈负相关，且miR-548c-3p、TRIM59mRNA的表达与TNM分期、淋巴结转移、分化程度和预后密切相关，二者有可能成为新的HCC诊治及预后的分子标志物。
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（收稿日期：2020-06-17）
15
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