中国小儿急救医学2020年12月第27卷第12期Chin Pediatr Emerg Med,Dec2020,Vol.27,No.12・899・
论著•
支气管肺发育不良新生大鼠长链非编码RNATugl的 战炳慧富建华薛辛东
中国医科大学附属盛京医院儿内科，沈阳110004
通信作者：薛辛东，Email:xuexd@sj-hospital,org
【摘要】目的研究长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(taurine upregulation gene1,Tugl)在新生
大鼠支气管肺发育不(bronchopulmonary dysplasia,BPD)模型中的表达，并从肺组织形态学及肺泡发 育成熟度两方面探究长链非编码RNA Tugl与肺发育的相关性，为阐明BPD中肺发育障碍的病理机制
奠定基础。方法采用高氧诱导新生SD大鼠制备BPD模型(氧浓度为85%=40)，对照组为空气环
境正常生长的新生SD大鼠(氧浓度21%/=40)。每组分别于生后1、3、7、14d随机取10只采集肺组
织样本。通过苏木精-伊红染观察肺组织形态学改变，应用辐射状肺泡计数法(RAC)评估肺泡发育成
熟度，利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测肺组织中长链非编码RNA Tugl及血小板源性生长因子
受体a(platelet derived growth factor receptor alpha,Pdgfra)的基因水平，用蛋白免疫印迹技术检测Pdgfra
的蛋白表达情况。结果在对照组,Tugl及Pdgfra的mRNA表达随日龄增加呈递增趋势，且Tugl的
表达与RAC值呈显著正相关(r=0.648,P=0.007)，与Pdgfra的mRNA表达呈正相关(r=0.572,P=
0.021)，与Pdgfra蛋白表达也呈正相关(r=0.755=0.001)o模型组中，Tugl表达从7d开始显著低
于对照组(0.78±0.20比1.68±0.20,P=0.04)，趋势持续至14d；Pdgfra的mRNA表达从7d开始显著进销存管理系统论文
低于对照组(1-04±0.25kt1.62±0.37,P=0.002)，趋势持续至14d o Pdgfra蛋白表达在对照组随日
龄增加呈递增趋势，模型组7d开始显著低于对照组(1.04±0.13比1.62±0.09,P=0.04)，趋势持续
至14氏结论长链非编码RNA Tugl与肺发育成熟度密切相关，其表达在正常发育肺组织中呈递增
趋势，新生大鼠BPD模型肺组织中Tugl表达下调可能是BPD肺泡发育障碍的发生机制之一。
【关键词】长链非编码RNA牛磺酸上调基因1；血小板源性生长因子受体a；支气管肺发育
不良；肺发育
基金项目：国家自然科学基金(81571479)
DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-4912.2020.12.004
Expression and role of long non-coding RNA taurine upregulation gene1in neonatal rats with bron・
chopulmonary dysplasia
Zhan Binghui,Fu Jianhua,Xue Xindong
Department of Pediatrics,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang110004,China
Corresponding author:Xue Xindong, Entail；xuexd@sj-hospital,org
[Abstract]Objective To study the expression of long non-coding RNA taurine upregulation gene1
(Tugl)in the model of bronchopulmonary dysplasia(BPD)in newborn rats.and explore the correlation
between Tugl and lung development from the aspects of lung histology and alveolar maturity,so as to lay a
foundation for elucidate the pathological mechanism of lung development disorders in BPD.Methods
Newborn SD rats induced by high oxygen were used to prepare BPD model(oxygen concentration was85%,
zj=40).The control group was newborn SD rats growing normally in air environment(oxygen concentration
was21%,n=40).In each group,ten lung tissue samples were randomly collected at1,3,7and14days after
birth.Pulmonary histopathological changes were observed by HE staining,the development of alveolar was
evaluated by radial alveolar count(RAC)Jhe expression levels of long non-coding RNA Tugl and platelet
derived growth factor receptor alpha(Pdgfra)in lung tissues were detected by real-time quantitative PCR
(RT-PCR),and the protein expression of Pdgfra was detected by western blot.Results In the control
嘌呤霉素
group,the expression level of Tugl and Pdgfra mRNA increased with age,and the expression of Tugl was
positively correlated with RAC value(r=0.701,P=0.01),as well as mRNA expression of Pdgfra(r=
0.701=0.01).In the model group,Tugl expression was significantly lower than that in the control group
[(1.68±0.20)in the control group,(0.78±0.20)in the model group,P=0.040]from day7,and the
decreasing trend continued to14days.The mRNA expression of Pdgfra in the model was significantly lower
than that in the control group[(1.62±0.37)in the control group,(1.04±0.25)in the model group,P=
・900・中国小儿急救医学2020年12月第27卷第12期Chin Pediair Emerg Med.Dec2020.Vol.27,No.12
0.(X)2]from day7to day14.Pdgfra protein expression level in the control group showed an increasing trend
办公自动化系统论文with the increase of daily age,and the trend of Pdgfra protein expression in the model group was significantly
lower than that in the control group from7days to14days.Conclusion Long non-coding RNA Tugl
expression is increasing in normal lung development,and down regulation of Tugl expression in neonatal rats
exposed to hyperoxia may be one of the mechanisms of alveolar developmenl disorders in BPD.
[Key words]Long chain non-coding RNA Tugl；Platelet-derived growth factor receptor alpha；Bronchopulmonary dysplasia；Lung development
Fund program:National Natural Science Foundation of China(81571479)
DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4912.2020.12.004
皮托管支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是早产儿常见的并发症之一。随着围产医学的迅速发展，呼吸支持策略的不断优化，肺表面活性物质的及时应用，极低和超低出生体重儿存活率逐渐升高，而BPD发病率也逐年上升。其遗留的短期或长期不良结局不仅影响患儿生命及生活质量，还给患儿家庭乃至整个社会带来沉重的经济负担⑴。
新型BPD的发生与肺发育不成熟有密切关系，胎龄小，出生体重低的早产儿更易患BPD⑺。胚胎肺发育分为5个时期，其中肺泡期为肺泡发育成熟的关键时期，大多数早产儿出生时肺发育处于囊泡期，肺部解剖结构及生理功能尚不成熟，极易受高氧、机械通气圧力等因素影响，使肺泡发育进程受阻，表现为肺发育停滞、肺泡简单化和肺小血管发育不良。大量研究证实血小板源性生长因子受体a(platelet derived growth factor receptor alpha,Pdgfra)是肺泡发育成熟度的标志，与肺发育不良密切相关，对Pdgfra(+)细胞进行遗传消融可使肺泡简单化门7。近年来长链非编码RNA 在多领域成为研究热点，其中长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(taurine upregulation gene1,Tugl)是一个与发育相关的指标，已被证实在大脑皮质、神经元及视网膜发育中扮演重要角W但是Tugl在发育中的肺组织及BPD中的表达还尚未见相关报道。本研究旨在阐明Tugl及Pdgfra在发育期肺组织及BPD动物模型中的表达情况，从肺组织形态学及肺泡发育成熟度方面探讨Tugl 与肺发育的相关性。
1材料与方法
1.1材料
1. 1.1对象及分组SPF级Sprague-Dawley (SD)大鼠20只(雌性16只，雄性4只.体重220-250g)，生产于北京华阜康生物科技股份有限公司。本研究所涉及的动物实验均经中国医科大学动物实验伦理委员会审批同意，外科手术均在钠麻醉后实施。于母鼠自然分娩后12h内将新生大鼠随机分为对照组(”=40)和模型组(”=40)。
1. 1.2试剂一抗anti-PDGFRA(沈阳Wanleibio 科技有限公司),anti-p-actin(美国Proteintech生物公司)，BCA蛋白质浓度测定试剂盒(Beyotime生物技术有限公司),SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(Beyotime生物技术有限公司)，TUG1及PDGFRA 引物(上海生工生物工程股份有限公司)。反转录试剂盒RR047A及PCR试剂盒RR820(Takara)0 1.2方法
1-2.1动物模型制备模型组于生后12h内放入氧箱，氧箱内FiO20.85,CO,<0.5%，湿度60%-70%，温度21~25贮。对照组以相同的护理条件置于空气环境饲养(FiO20.21)o每天定时交换模型组与对照组母鼠.每组分别于生后I、3、7及14d随机选取10只幼鼠采集肺组织*。
1.2.2标本采集在生后1、3、7、14d分别从模型组和对照组随机抽取10只幼鼠，腹腔注射1%钠(0.06mL/g)麻醉后，剪开左心耳，从右心室刺入头皮针，将PBS缓慢持续注入肺循环系统直至无透明液体从左心耳流出。用4%多聚甲醛固定右肺下叶用于制备石蜡切片，其余肺组织迅速放入液氮转移至-80丈保存，用于RT-PCR及Wesstern blot等实验。
1.2.3HE染及辐射状肺泡计数(radial alveolar count,RAC)值测定将3pm石蜡切片脱蜡后进行HE染，在光学显微镜下观察。每组于4个时间点分别选取8张组织切片用于组织形态学分析，从呼吸性细支气管中心至最近纤维隔(或胸膜)引一条垂线，该垂线上的肺泡个数即为RAC值3
1.2.4实时荧光定量PCR检测Tugl及Pdgfra的基因表达随机选取冻存肺组织，提取总RNA，使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，用TB-Green试剂盒及引物，采用20pL体系进行定量PCR扩增，见表1。
1.2.5Western blot检测Pdgfra蛋白表达水平
随机选取冻存肺组织提取蛋白，并测蛋白浓度。按比例上样后进行凝胶电泳、转膜，封闭.TBST清洗后，加入一抗4t摇床过夜。次日回收一抗,
中国小儿急救医学2020年12月第27卷第12期Chin Pediatr Emerg Med,Dec2020,Vol.27,No.12・901・
TBST清洗，加入二抗室温孵育2h,TBST洗净后
化学发光法显，用灰度值表示结果。
三峡情缘网表1实时荧光定量PCR引物
基因名称正向引物(5'一3，)反向引物
Tugl GGCGTATAGAAGGTT-
GGCAGCAG
ACTTGGCAAGCAG-
GTCTGTGATG
Pdgfra GTGCCGCTGAGT-
TCGTCCTTC
GCTGAGGCGTTGAC-
CACTTCC
p-actin TGTCACCAACTGG-
GACGATA
GGGGTGTTGAAG-
GTCTCAAA
1.2.6统计学分析应用SPSS20.0和Graphpad Prism7.0软件进行统计学分析及作图，计量资料以均数士标准差(Mean±SD)表示，两样本均数比较采用独立样本f检验，采用皮尔逊相关系数法进行相关性分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1肺组织形态学变化正常肺组织生后1d形态表现为肺泡数目少、间隔较厚，肺组织形态结构不规则；随发育时间延长，肺泡数目越来越多，肺泡间隔越变越薄且数目增多，肺组织结构和肺泡形态大小逐渐变得有规律。与对照组相比，模型组3d肺泡间隔稍厚;7d肺泡数目少，肺泡间隔变厚，血管充血，间质水肿;14d肺泡间隔数目减少，肺泡体积增大，肺泡融合且数目减少，形态不规则。
人-。：对照组1<1、3(1、7<1、14<1止-比模型组1d、3d、7d、14d。
图1对照组和模型组大鼠肺组织HE染(X200) 2.2RAC值正常肺组织随发育时间延长,RAC 值逐渐升高,7d和14d较1d均显著增加(P< 0.01)，提示对照组肺发育逐渐成熟。与对照组相比，模型组1d及3d RAC值差异无统计学意义; 7d和14d RAC值显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，提示模型组肺发
育阻滞，见图2。
2.3肺组织中Tugl与Pdgfra的基因表达水平
对照组中Tugl的表达量在1、3、7、14d呈递增趋势,7、14d较第1天显著增加(P<0.05)；与对照组相比,7J4d BPD组Tugl的表达量显著降低(P<0.05)；对照组中Pdgfra的mRNA表达量随时间呈递增趋势,7d和14d显著高于1d(P< 0.05)；与对照组相比，模型组从3d开始显著低于对照组，趋势保持至14d(P<0.05)，见图3。
15
Q］廿照组
曰模电组
5
与对照组比较,*P<0.05；与同组1d比较，吓<0.05。
图2辐射状肺泡计数值评估肺发育成熟度
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
a对照组
口模型组
3d7d14d
1d
B
n
坦<
灰
%
0.0
A.Tugl的组织表达；
B.Pdgfra的mRNA组织表达；与对照组比较,*/><0.05；与同组1d比较,bp<0.05；Tugl：长链非编码RNA牛磺酸上调基因1;Pdgfra：血小板源性生长因子受体a。
图3肺组织中Tugl与Pdgfra的基因表达水平
对照组模型组对照组模型组对照组模型组对照组模型组
d3d7d4d
Pdgfra
B-actin
«
均
嵌
反
冥
-E
驷
e
H
p
d
与对照组比较,a P<0.05；与同组1d比较,b P<0.05；Pdgfra：血小板源性生长因子受体a。
图4肺组织中Pdgfra蛋白表达水平(p-actin为内参) 2.4肺组织中Pdgfra的蛋白表达水平对照组Pdgfra
的蛋白表达量随发育时间的延长呈递增趋
• 902 •中国小儿急救医学 2020 年 12 月第 27 卷第 12 期 Chin Pediatr Emerg Med.Dec 2020, Vol.
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势,7 J4d 较第1天显著增加（P<o. 05）；与对照 组相比,7 d 和14 d 模型组中Pdgfra 的蛋白表达量
显著降低（P<0. 05），见图4。
2. 5对照组肺组织中Tugl 的表达与RAC 值及
Pdgfra mRNA 和蛋白表达的相关性分析 Tugl 的 表达量与RAC 值及Pdgfra mRNA 和蛋白表达量 呈显著正相关，见图5。
3讨论
目前，经典的BPD 已很少见，大多数是以肺泡 发育障碍和微血管结构紊乱为主要病理改变的新
型BPD o 胚胎肺发育是一个非常复杂而重要 的过程，主要分为5个时期：胚胎期（胎龄3 ~
7周）、腺体期（胎龄5 ~17周）、小管期（胎龄16 ~
26周）、囊泡期（胎龄24 ~38周）和肺泡期（胎龄 36周至生后3岁）。大鼠肺发育囊泡期为胎龄21 d
至生后3 d，肺泡期为生后4 ~21 d 11 o 新生大鼠
肺发育相当于胎龄28周人肺发育情况，因其肺分 化的时序性与人相似，故对生后12 h 内的新生大 鼠进行高氧诱导制造BPD 模型，能够很好模拟处
于囊泡期的早产儿BPD 的发生。处于囊泡期的肺 组织气道扩张但肺实质发育不成熟，受高氧、机械 通气时压力等因素的影响"2〕，将导致肺泡发育进
程受阻.肺泡简单化、肺泡数目减少、正常肺结构 消失、肺泡融合、肺泡间隔增厚，间质纤维化、肺血 管生成紊乱等病理学改变，即囊泡期向肺泡期过
渡障碍⑴）。肺泡形成是肺成熟的最后一步，将肺 囊泡区细分为更小的肺泡，新生的间隔极大增加
了气体交换表面积，而肺泡发育障碍将导致终身
呼吸不足側）。
为使肺发育有序进行，各种多肽类生长因子
之间相互作用，彼此协调，调控不同细胞的增殖、 分化和凋亡。这些生长因子的分布和表达具有精
确的时序性，任何干预其正常表达的因素都将对 肺组织的发育产生深远影响。血小板衍生生长因
子（PDGF ）家族由四种配体（PDGF-A 、B 、C 、D ）组
成，通过两个酪氨酸激酶受体（PDGFR-a 、-0）发挥 作用山打Pdgfra 基因敲除小鼠在妊娠中期死亡，
其多种组织间质发育失败;⑷。胚胎发育后期，肺
间质Pdgfra 的条件失活将导致肺泡简化，提示其 在中隔曙的形成过程中至关重要心。Pdgfra 可作 为肺泡发育成熟度的标志，在成人肺中,Pdgfra
（+ ）细胞被认为与肺泡0型上皮细胞（AEC D ）非
常接近，并支持AECD 的增殖和分化‘讯。在肺泡 形成过程中，肌成纤维细胞中表达的Pdgfra 可参 与肺泡的正常和异常形成，在患有BPD 的新生儿
间质细胞中发现Pdgfra 表达水平降低v 。本研究
对照组模型中，Pdgfra 在肺组织中的表达随肺发育 时间延长逐渐增加；在BPD 模型中Pdgfra 的表达
从7d 开始显著低于对照组。
长链非编码RNA 是指转录本长度>200 nt,
不能编码蛋白质的一类RNA 分子，可在表观遗传
学、转录及转录后3个水平调控基因表达，参与细 胞增殖、分化、凋亡等生命过程id ”）。有研究证
实IncRNA 可在空间上与转录因子相互作用进而
调控肺的发育进程，并影响BPD 的发生发展⑺
IncRNA Tugl 是一种广泛分布于人体各组织中长
约7. 1 kb，定位于人类染体22ql2. 2的
IncRNA 7 0 Tugl 广泛存在于新生小鼠的视网膜
及大脑皮质中，敲除Tugl 会使小鼠视网膜前体细 胞分化障碍，终末分化的视锥细胞和视杆细胞比 例也会发生变化⑺）。本研究发现,Tugl 的表达在 正常肺组织中随发育进程呈递增趋势，且分别与
肺泡发育成熟度指标Pdgfra 及形态学标准RAC 值呈显著正相关。而在BPD 模型中，从7d 开始
Tugl 的表达显著低于对照组，这与Pdgfra 的表达
及RAC 值的趋势是一致的。因此本研究从肺组
织形态学及肺泡发育成熟度标志物两方面证实了
Tugl 与肺发育密切相关。
A.对照组中Tugl 的表达与RAC 值呈显普正相关；
B.对照组中Tugl 的表达与Pdgfra 的mRNA 表达呈显著正相关；
C.对照组中
Tugl 的表达与Pdgfra 的蛋白表达呈显著正相关；RAC ：辐射状肺泡计数；Tugl ：长链非编码RNA
牛磺酸上调基因1;Pdgfra ：血小板源性朱 长因子受体a.
图5对照组肺组织中Tugl 的表达与RAC 值及Pdgfra
表达的相关性分析
中国小儿急救医学2020年12月第27卷第12期Chin Pediatr Emerg Med,Dec2020,Vol.27,No.12•903•
本研究首次在新生大鼠肺发育及BPD模型中检测Tugl的表达情况，从肺组织形态学及肺泡发育成熟度标志物两方面阐述了Tugl与肺发育的相关性，及其可能是BPD中肺泡发育障碍的原因之一。但Tugl在肺发育过程中的具体作用机制及其与Pdgfra之间是否具有相互作用仍需要进一步探索，为BPD肺发育障碍的发病机制研究奠定基础。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献
1Alvarez-Fuente M,Arruza L,Muro M,et al.The economic impact of prematurity and bronchopulmonary dysplasia[J].Eur J Pediatr,2017,176(12)：1587-1593.DOI：10.1007/s00431-017-3009-6.
[2]Jobe AH.The new bronchopulmonary dysplasia[J].Curr Opin
Pediatr,2011,23(2)：167-172.DOI：10.1097/MOP.
0b013e3283423e6b.
[3]Popova AP,Bentley JK,Cui TX,et al.Reduced platelet-derived
growth factor receptor expression is a primary feature of human bronchopulmonary dysplasia[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2014,307(3)：L231-239.DOI：10.1152/ajplung.
00342.2013.
[4]Li R,Bemau K,Sandbo N,et al.Pdgfra marks a cellular lineage
with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response[J].Elife,2018,7：e36865.DOI：10.7554/ eLife.36865.
[5]Wu P,Zuo X,Deng H,et al.Roles of long noncoding RNAs in
brain development,functional diversification and neurodegener-ative diseases[J].Brain Res Bull,2013,
97:69-80.DOI:10.
1016/j.brainresbull.2013.06.001.
[6]Guo Y,Chen X,Xing R,et al.Interplay between FMRP and
IncRNA TUG I regulates axonal development through mediating SnoN-Ccdl pathway[J].Hum Mol Genet,2018,27(3)：475-485.DOI：10.IO93/hmg/ddx417.
[7]Young TL,Matsuda T,Cepko CL,et al.The noncoding RNA
taurine upregulated gene1is required for differentiation of the murine retina[J].Curr Biol,2005,15(6)：501-512.DOI：10.
1016/j.cub.2005.02.027.
[8]Zhu Y,Fu J,Yang H,et al.Hyperoxia-induced methylation de
creases RUNX3in a newborn rat model of bronchopulmonary dysplasia[J].Respir Res,2015,16(1)：75.DOI：10.1186/ S12931-015-0239-X.
[9]Hou A,Fu J.Yang H,et al.Hyperoxia stimulates the transdiffer
entiation of type II alveolar epithelial cells in newborn rats[J].
Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2015,308(9):L861-872.
DOI：10.1152/ajplung.00099.2014.[10]Simpson SJ,Hall GL,Wilson AC.Lung function following very
preterm birth in the era of'new'bronchopulmonary dysplasia [J].Respirology,2015,20(4)：535.DOI：10.Ill1/resp.
12503.
[11]Manji JS,O'Kelly CJ,Leung WI,et al.Timing of hyperoxic ex
posure during alveolarization influences damage mediated by leukotrienes[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2001, 281(4):L799-806.DOI：10.1152/ajplung.2001.281.4.L799.
[12]贾昕，梅花，张铉恒，等•早产儿支气管肺发育不良的危险因
素研究进展[J].中国小儿急救医学,2016,23(10):707-710.
DOI：10.3760/cma.j.issn.1673^912.2016.10.014.
[13]Gaiambos C,Sims-Lucas S,Abman SH,et al.Histologic evi
dence of intrapulmonary anastomoses by three-di m ensional reconstruction in severe bronchopulmonary dysplasia[J].Ann Am Thorac Soc,2013,10(5)：474-48i.DOI：10.1513/Annal-sATS.201305-124OC.
[14]Gaiambos C,Demello DE.Regulation of alveologenesis:clinical
implications of impaired growth[J].Pathology,2008,40(2): 124-140.DOI：10.1080/00313020701818981.
[15]Andrae J, Gallini R,Betsholtz C.Role of platelet-derived growth
factors in physiology and medicine[J].Genes Dev,2008,22
(10)：1276-1312.DOI：10.1101/gad.1653708.
[16]Soriano P.The PDGF alpha receptor is required for neural crest
cell development and for normal patterning of the somites[J].
Development,1997,124(14)：2691-2700.DOI：10.1007/ S004290050081.
[17j Mcgowan SE,Mccoy DM.Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice [J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2014,307(8)：618-631.DOI：10.1152/ajplung.00144.2014.
[18]Barkauskas CE,Cronce MJ,Rackley CR,et al.Type2alveolar
cells are stem cells in adult lung[J].J Clin Invest,2013,123
圣格(7)：3025-3036.DOI：10.1172/jci68782.
[19]Batista PJ,Chang HY,Chang HY.Long noncoding RNAs：cel
lular address codes in development and disease[J].Cell,2013, 152(6)：1298-1307.DOI：10.ll.2013.02.012. [20]Yang Y,Umetsu J,Lu ZJ,et al.Global signatures of protein
binding on structured RNAs in Saccharomyces cerevisiae[J].
Sci China Life Sci,2014,57(1)：22-35.DOI：10.1007/sl1427-01345830
[21]Herriges MJ,Swarr DT,Morley MP,et al.Long noncoding
RNAs are spatially correlated with transcription factors and regulate lung development[J].Genes Dev,2014,28(12):1363-1379.DOI：10.1101/gad.238782.114.
[22]Yang L,Lin C,Liu W,RNA-and Pc2methylation-de
pendent gene relocation between nuclear structures mediates gene activation programs[J].Cell,2011,147(4)：773-788.
(收稿日期:2019-11-29)
(本文编辑：张薇)
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