ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－７３８６．２０２１．０７．００１
·论著·
刘杰 李萍 高彦霞 吴瑶
项目来源：陕西省科学技术计划项目（编号：２０１７ＳＦ ２６１）作者单位：
７１０００４ 西安市，西安交通大学第二附属医院急诊科通讯作者：李萍，７１０００４ 西安市，西安交通大学第二附属医院急诊科；
Ｅ ｍａｉｌ：ｉｅｐｈｐｕ＠１６３．ｃｏｍ
【摘要】 目的 观察毛蕊异黄酮减轻脓毒症大鼠心肌损伤的作用，并探讨其是否能够调控Ｔｏｌｌ样受体４（ＴＬＲ４）／丝裂原活化蛋白激酶（ｐ３８ＭＡＰＫ）通路发挥此作用及具体的机制。方法 ５４只成年ＳＤ大鼠随机分为６组，
除正常对照组（
ＮＣ组）外其余均建立脓毒症模型。成功后阳性对照组（ＰＣ组）予以乌司他丁１００ｋＵ／ｋｇ溶于１ｍｌ／１００ｇ０．９％氯化钠溶液中经腹腔注射，低、中、高浓度组（Ａ、Ｂ、Ｃ组）分别予以５、１０、２０ｍｇ／ｋｇ毛蕊异黄酮溶于１ｍｌ／１００ｇ０．９％氯化钠溶液中经腹腔注射；模型对照组（ＭＣ组）和ＮＣ组均予以１ｍｌ／１００ｇ０．９％氯化钠溶液经腹腔注射。１次／ｄ，干预１周。干预后均处死，对比干预后心肌组织ＴＬＲ４、肿瘤坏死因子 α（ＴＮＦ α）、一氧化氮（ＮＯ）含量；苏木素 伊红染法（ＨＥ）观察心肌组织病理情况；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（ＴＵＮＥＬ）检测心肌 组织细胞凋亡指数（
ＡＩ）；实时聚合酶链反应（ＲＴ ＰＣＲ）检测心肌组织ＴＬＲ４、ｐ３８ＭＡＰＫｍＲＮＡ表达；蛋白质免疫印迹法（ＷＢ）检测心肌组织ＴＬＲ４、ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表达和磷酸化ｐ３８ＭＡＰＫ（ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ）水平。结果 ＭＣ组心肌组织ＴＬＲ４、ＴＮＦ α
、ＮＯ含量，心肌细胞ＡＩ均较ＮＣ组升高（Ｐ＜０．０１），ＰＣ组和３浓度组均较ＭＣ组下降（Ｐ＜０．０１），ＰＣ组、Ｂ组、Ｃ组均较Ａ组下降（Ｐ＜０．０１），Ｃ组均较ＰＣ组、Ｂ组下降（Ｐ＜０．０１）；ＭＣ组心肌纤维和细胞均呈严重病理改变，ＰＣ组和３个浓度组病理变化均显著减轻，且Ｃ组与ＮＣ组最为接近；ＭＣ组心肌组织ＴＬＲ４ｍＲＮＡ及蛋白，ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ水平均
高于ＮＣ组（Ｐ＜０．０１），ＰＣ组和３个浓度组均低于ＭＣ组（Ｐ＜０．０１），ＰＣ组、Ｂ组、Ｃ组均较Ａ组下降（Ｐ＜０．０１），Ｃ组均较ＰＣ组和Ｂ组下降（Ｐ＜０．０１）。结论 对脓毒症大鼠腹腔注射毛蕊异黄酮可控制心肌组织炎性反应，减轻病理改
变，抑制心肌细胞凋亡，且其作用呈浓度依赖性，推测与抑制Ｔ
ＬＲ４ｍＲＮＡ与蛋白表达，控制ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ有关。【关键词】 毛蕊异黄酮；Ｔｏｌｌ样受体４；丝裂原活化蛋白激酶；脓毒症；心肌损伤；炎性反应【中图分类号】 Ｒ６３１ 【文献标识码】 Ａ 【文章编号】 １００２－７３８６（２０２１）０７－０９６５－０６ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＣａｌｙｃｏｓｉｎｏｎｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｊｕｒｙｉｎｒａｔｓｗｉｔｈｓｅｐｓｉｓｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＴＬＲ４／ｐ３８ＭＡＰＫｐａｔｈｗａｙ ＬＩＵＪｉｅ，ＬＩＰｉｎｇ，ＧＡＯＹａｎｘｉａ，ｅｔａｌ．ＥｍｅｒｇｅｎｃｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ，ＴｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＸｉ’ａｎＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａａｘｉ，Ｘｉ’ａｎ７１０００４，Ｃｈｉｎａ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＣａｌｙｃｏｓｉｎｏｎｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｊｕｒｙｉｎｒａｔｓｗｉｔｈｓｅｐｓｉ
ｓ，ａｎｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｗｈｅｔｈｅｒｉｔｃａｎｒｅｇｕｌａｔｅＴｏｌｌ ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ４（ＴＬＲ４）／ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ（ｐ３８ＭＡＰＫ）ｐａｔｈｗａｙａｎｄｉｔｓａｃｔｉｏｎ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｉｆｔｙ ｆｏｕｒａｄｕｌｔＳＤｒａｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｓｉｘｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅｒａｔｍｏｄｅｌｓｗｉｔｈｓｅｐｓｉｓｗｅｒｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｅｘｃｅｐｔｆｏｒｔｈｏｓｅｉｎｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ＮＣｇｒｏｕｐ）．Ａｆｔｅｒｔｈｅｒａｔｍｏｄｅｌｓｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ｔｈｅｒａｔｓｉｎｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ＰＣｇｒｏｕｐ）ｗｅｒｅｉｎｊｅｃｔｅｄｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙｗｉｔｈｕｌｉｎａｓｔａｔｉｎ１００ｋＵ／ｋｇｄｉｓｓｏｌｖｅｄｉｎ１ｍｌ／１００ｇｓａｌｉｎｅ．Ｔｈｅ
ｒａｔｓｉｎｌｏｗ
，ｍｅｄｉｕｍａｎｄｈｉｇｈｄｏｓｅｇｒｏｕｐｓ（ｇｒｏｕｐＡ，ＢａｎｄＣ）ｗｅｒｅｉｎｊｅｃｔｅｄｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙｗｉｔｈ５ｍｇ，１０ｍｇａｎｄ２０ｍｇ／ｋｇｏｆＣａｌｙｃｏｓｉｎｄｉｓｓｏｌｖｅｄｉｎ１ｍｌ／１００ｇｓａｌｉｎｅ，ｒｅｓｐｅｃ
ｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｒａｔｓｉｎｍｏｄｅｌｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ＭＣｇｒｏｕｐ）ａｎｄＮＣｇｒｏｕｐｗｅｒｅｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈ１ｍｌ／１００ｇｓａｌｉｎｅ，ｏｎｃｅａｄａｙｆｏｒａｗｅｅｋ．Ａｆｔｅｒｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ，ａｌｌｔｈｅｒａｔｓｗｅｒｅｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ，ａｎｄｔｈｅ
ｌｅｖｅｌｓｏｆＴＬＲ４，ＴＮＦ αａ
ｎｄＮＯｉｎｍｙｏｃａｒｄｉａｌｔｉｓｓｕｅｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ｅｏｓｉｎｓｔａｉｎｉｎｇ（ＨＥ）ｗａｓｕｓｅｄｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ．Ａｐｏｐｔｏｔｉｃｉｎｄｅｘ（ＡＩ）ｏｆｃａｒｄｉａｃｍｙｏｃｙｔｅｓｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｅｒｍｉｎａｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｍｅｄｉａｔｅｄｎｉｃｋｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）．Ｒｅａｌ ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ ＰＣＲ）ｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＴＬＲ４ａｎｄｐ３８ＭＡＰＫｉｎｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ．ＭｏｒｅｏｖｅｒｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＴＬＲ４，ｐ３８ＭＡＰＫａｎｄ
ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄｐ３８ＭＡＰＫ（
ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ）ｉｎｍｙｏｃａｒｄｉｕｍｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＴｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＴＬＲ４，ＴＮＦ α，ＮＯａｎｄＡＩｉｎｍｙｏｃａｒｄｉａｌｔｉｓｓｕｅｓｉｎＭＣｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎＮＣｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１），ｈｏｗｅｖｅｒ，ｗｈｉｃｈｉｎＰＣｇｒｏｕｐａｎｄｇｒｏｕｐＡ，Ｂ，ＣｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎＭＣｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１），ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｗｈｉｃｈｉｎＰＣｇｒｏｕｐ，ｇｒｏｕｐＢａｎｄｇｒｏｕｐＣｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｇｒｏｕｐＡ（Ｐ＜０．０１），ａｎｄｗｈｉｃｈｉｎｇｒｏｕｐＣｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎＰＣｇｒｏｕｐａｎｄｇｒｏｕｐＢ（Ｐ＜０．０１）．ＴｈｅｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｍｙｏｃａｒｄｉａｌｆｉｂｅｒｓａｎｄｃｅｌｌｓｉｎＭＣｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｅｒｉｏｕｓ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ｗｈｉｃｈｉｎＰＣｇｒｏｕｐａｎｄｇｒｏｕｐＡ，Ｂ，Ｃｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｌｌｅｖｉａｔｅｄ，ｗｈｉｃｈｉｎｇｒｏｕｐＣｗｅｒｅｔｈｅｃｌｏｓｅｓｔｔｏｔｈｏｓｅ
ｉｎＮＣｇｒｏｕｐ．ＴｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＴＬＲ４ｇｅｎｅａｎｄｐｒｏｔｅｉｎ，ｐ
ｐ３８ＭＡＰＫｉｎｍｙｏｃａｒｄｉａｌｔｉｓｓｕｅｉｎＭＣｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎＮＣｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１），ｗｈｉｃ
ｈｉｎＰＣｇｒｏｕｐａｎｄｇｒｏｕｐＡ，Ｂ，ＣｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎＭＣｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１），ｈｏｗｅｖｅｒ，ｗｈｉｃｈｉｎＰＣｇｒｏｕｐ，ｇｒｏｕｐＢａｎｄ
ｇｒｏｕｐＣｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｇｒｏｕｐＡ（Ｐ＜０．０１），ｗｈｉｃｈｉｎｇｒｏｕｐＣｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎＰＣｇｒｏｕｐａｎｄｇｒｏｕｐＢ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＴｈｅｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆＣａｌｙｃｏｓｉｎｆｏｒｔｈｅｒａｔｓｗｉｔｈｓｅｐｓｉｓｃａｎｃｏｎｔｒｏｌｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ａｌｌｅｖｉａｔｅｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ，ａｎｄｉｔｓａｃｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｍａｙｂｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＴＬＲ４ｇｅｎｅａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆｐ ｐ３８ＭＡＰＫｐａｔｈｗａｙ．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】 Ｃａｌｙｃｏｓｉｎ；Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ４；ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ；ｓｅｐｓｉｓ；ｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｊｕｒｙ；ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒｅａｃｔｉｏｎ
路易士
脓毒症是常见的、严重的全身炎性反应综合征，也是临床上常见的死亡病因。据报道，我国脓毒症的发病率高，且近年来一直保持着居高不下的态势［１］。有资料显示，脓毒症可发展为多脏器功能衰竭，病死率高达３０％～５０％，是严重困扰医务工作者的重大疾病之一［２］。目前临床针对脓毒症患者常用的手段包括控制感染、早期液体复苏、清除内毒素等，可控制病情，降低病死率，但仍有部分患者病情进展。心肌损伤是脓毒症常见的继发症，可削弱心功能甚至诱发心力衰竭［３］。Ｔｏｌｌ样受体４（ＴＬＲ４）／丝裂原活化蛋白激酶（ｐ３８ＭＡＰＫ）通路是炎性反应性疾病经典的信号传导途径，在炎症环境中该通路被激活，ＴＬＲ４高表达，增加磷酸化ｐ３８ＭＡＰＫ（ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ）水平，诱发组织损伤，已被证实与脓毒症心肌损伤有关［４－６］。毛蕊异黄酮是一种常用的化学药品原料，具有抗氧化、保护心脑血管、舒张血管平滑肌等作用，有研究报道该药物可减轻心肌损伤［７］。故此推测毛蕊异黄酮可能通过调控ＴＬＲ４／ｐ３８ＭＡＰＫ通路减轻脓毒症心肌损伤，但仍缺乏有力证据，需深入探讨验证。鉴于此本研究特设计大鼠对照试验，并将不同浓度毛蕊异黄酮的作用与乌司他丁做对比，明确该药物对脓毒症大鼠心肌损伤的作用及可能机制。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 动物：５４只成年ＳＤ大鼠，７～９周龄，无特定病原体级，雌２７只雄２７只，１８０～２２０ｇ，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物合格证号：ＳＣＸＫ（京）２０１８ ０００１。
１．１．２ 试剂：毛蕊异黄酮（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥９８％）；乌司他丁（广东天普生化医药股份有限公司）；０．９％氯化钠溶液（北京高科恒辉技术发展有限公司）；鼠ＴＬＲ４、ＴＮＦ α、ＮＯ酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测试剂盒（武汉赛培生物科技有限公司）；苏木素 伊红染（ＨＥ）试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（ＴＵＮＥＬ）试剂盒（美国Ｒｏｃｈｅ公司）；Ｔｒｉｚｏｌ试剂（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）；ＴＬＲ４、ｐ３８ＭＡＰＫ及内参β ａｃｔｉｎ上下游引物合成（上海生工科技有限公司）；二喹啉甲酸（ＢＣＡ）蛋白定量试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）；兔抗鼠ＴＬＲ４、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ单克隆抗体（一抗）（美国Ａｃａｄｍ公司）；山羊抗兔ＴＬＲ４、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ多克隆抗体（以酶标记，二抗）（美国Ａｃａｄｍ公司）；聚偏氟乙烯（ＰＶＤＦ）膜（上海化科实验器材有限公司）。１．１．３ 仪器：超净工作台（美国Ｌａｂｃｏｎｃｏ公司）；１４型台式离心机（德国Ｓｉｇｍａ公司）；ＲＭ２２３５型切片机（德国Ｌｅｉｃａ公司）；ＤＳＸ１０００型光学显微镜（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司）；７５００型聚合酶链反应（ＰＣＩ）扩增仪及配套分析软件（美国ＡＢＩ公司）；Ｔｒａｎｓ ＢｌｏｔＴｕｒ
ｂｏ型转膜仪（美国Ｂｉｏ Ｒａｄ公司）；ＧｅｌＤｏｃＥＺ型凝胶成像分析系统（美国Ｂｉｏ Ｒａｄ公司）。
１．２ 方法
１．２．１ 分组、建模：５４只成年ＳＤ大鼠随机分为６组，包括正常对照组（ＮＣ）、模型对照组（ＭＣ）、阳性对照组（ＰＣ）、毛蕊异黄酮低浓度组（Ａ）、毛蕊异黄酮中浓度组（Ｂ）、毛蕊异黄酮高浓度组（Ｃ），每组９只。除正常对照组（ＮＣ）外其余均建立脓毒症模型，建模方法：参照文献［８］，方法为盲肠结扎穿孔术，具体操作：腹腔注射麻醉，腹正中位置做长约１．５ｃｍ切口，寻盲肠，结扎其根部。以１８Ｇ针穿通２次，将肠内容物挤出少量。留置２ｃｍ皮瓣，还纳盲肠，对腹壁切口逐层缝合，术后常规抗感染、抗休克。ＮＣ组操作大致同上，但无需实施环形结扎和穿孔操作。１．２．２ 药物：ＰＣ组予以乌司他丁１００ｋＵ／ｋｇ溶于１ｍｌ／１００ｇ０．９％氯化钠溶液中经腹腔注射；干预Ａ、Ｂ和Ｃ组分别予以５、１０、２０ｍｇ／ｋｇ毛蕊异黄酮溶于１ｍｌ／１００ｇ０．９％氯化钠溶液中经腹腔注射；ＭＣ和ＮＣ组均予以１ｍｌ／１００ｇ０．９％氯化钠溶液经腹腔注射。１次／ｄ，干预１周。
１．２．３ 心肌组织ＴＬＲ４、ＴＮＦ α、ＮＯ含量检测：采用ＥＬＩＳＡ检测。麻醉下处死大鼠，迅速剥离心脏组织，取约４０ｍｇ心尖周围组织匀浆，按照３５００ｒ／ｍｉｎ转速离心１０ｍ
ｉｎ，离心半径为８ｃｍ。取上清并严格按照ＥＬＩＳＡ试剂盒检测心肌组织ＴＬＲ４、ＴＮＦ α、ＮＯ含量。
１．２．４ 心肌组织病理改变观察和细胞凋亡检测：采用ＨＥ法观察心肌组织病理改变，具体操作：同上述方法取心肌组织，固定、包埋、切片、脱蜡和水化，严格按照ＨＥ试剂盒染，封片。在４００倍光镜下观察心肌纤维和心肌细胞变化。采用ＴＵＮＥＬ法检测心肌细胞凋亡指数（ＡＩ），具体操作：严格按照ＴＵＮＬＥ试剂盒操作，阳性染为凋亡细胞。光镜下随机选取１０个不重复视野统计阳性细胞占比，计算均值即为ＡＩ。１．２．５ 心肌组织ＴＬＲ４、ｐ３８ＭＡＰＫｍＲＮＡ表达检测：采用实时ＰＣＲ（ＲＴ ＰＣＲ）检测，具体操作：同上述方法取心肌组织，液氮冷冻，匀浆后加入Ｔｒｉｚｏｌ试剂１ｍｌ，反复研磨。按照１４０００ｒ／ｍｉｎ转速离心１０ｍｉｎ，离心半径为３ｃｍ。以酚 氯仿抽提核糖核酸（ＲＮＡ），逆转录。按照说明书配置反应体系，其中ＴＬＲ４上游引物：５’ ＡＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＡＴＧＡＴＣＧＡＴＡＧＣＴＡＴ ３’；下游引物：５’ ＴＣＧＡＴＡＧＣＴＡＧＡＴＣＧＡＴＴＡＧＣＴＡＴＧＡＴＣＴＡＧ ３’，长度１８ｂｐ、２０ｂｐ；ｐ３８ＭＡＰＫ上游引物：５’ ＴＡＣＧＣＴＡＧＡＴＴＴＡＧＣＴＡＴＡＧＣＴＡＧＧＣＧＡＡＣＴＣ ３’；下游引物：５’ ＡＴＣＧＣＴＡＧＡＴＣＧＡＴＡＴＡＴＣＧＡＴＣＧＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡ ３’，长度２０ｂｐ、２０ｂｐ；β ａｃｔｉｎ为内参，上游引物：５’ ＣＴＧＣＴＡＧＡＴＧＣＴＴＡＴＡＧＣＴＡＴＴＡＧＣＴＡＴＡＧＣＴＡＧＡＴＣＧＡＣＴＡＧＴ ３’；下游引物：５’ＡＴ
ＧＣＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＧＣＴＡＴＡＧＣＴＡＧＡＴＣＧＡＣＣＧ ３’，长度２０ｂｐ、２０ｂｐ。按照如下流程进行扩增反应，９５℃（３０ｓ预变性），３５个循环：９５℃（５ｓ变性）、５８℃（２０ｓ延伸），最后６０℃（５ｍｉｎ持续延伸）。采用配套分析软件确定目的基因的相对表达量，即２ ΔΔＣｔ。
１．２．６ 心肌组织ＴＬＲ４、ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表达和ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ水平检测：采用蛋白质免疫印迹法（ＷＢ）检测，具体操作：同上述方法取心肌组织，液氮冷冻，匀浆。按照１４０００ｒ／ｍｉｎ转速离心１０ｍｉｎ，离心半径为３ｃｍ。取上清液分离总蛋白，采用ＢＣＡ试剂盒定量，转移至ＰＶＤＦ膜。封闭后加入一抗，孵育过夜（４℃）；加入二抗，孵育２ｈ（２５℃）。显并采用凝胶成像分析系统扫描，分析结果，计算蛋白相对表达量和ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ水平，其中前者为目的蛋白的灰度值与内参β ａｃｔｉｎ灰度值的比值，后者为ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ的灰度值与ｐ３８ＭＡＰＫ灰度值的比值。
１．３ 统计学分析 应用ＳＰＳＳ２５．０统计软件，计量资料以珋ｘ±ｓ表示，采用单因素方差分析及ＳＮＫ ｑ检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
２ 结果
２．１ 干预后心肌组织ＴＬＲ４、ＴＮＦ α、ＮＯ含量比较 ＭＣ、ＰＣ、Ａ、Ｂ、Ｃ组实验期间
分别有１只、１只、１只、１只、０只建模失败，建模成功率为９１．１１％（４１／４５），无大鼠意外死亡。干预后ＭＣ组心肌组织ＴＬＲ４、ＴＮＦ α、ＮＯ含量均高于ＮＣ组（Ｐ＜０．０１），且ＰＣ组、Ａ组、Ｂ组、Ｃ组均低于ＭＣ组（Ｐ＜０．０１），ＰＣ组、Ｂ组和Ｃ组均低于Ａ组（Ｐ＜０．０１），Ｃ组均低于ＰＣ组和Ｂ组（Ｐ＜０．０１）。见表１。
表１ 干预后心肌组织ＴＬＲ４、ＴＮＦ α、ＮＯ含量比较珋ｘ±ｓ
组别ＴＬＲ４（ｐｇ／ｇ湿重）ＴＮＦ α（ｐｇ／ｇ湿重）ＮＯ（ｐｇ／ｇ湿重）ＮＣ组（ｎ＝９）４０．０８±４．９５８６．４５±１０．９３０．７１±０．１３
ＭＣ组（ｎ＝８）２０５．９８±３６．９５ ７８２．３９±１０５．５６ ２．６９±０．４１
ＰＣ组（ｎ＝８）８９．２２±１０．７７ ＃３１２．３８±６１．０７ ＃１．３６±０．２５ ＃
Ａ组（ｎ＝８） １２５．４５±２１．７９ ＃△５１０．３３±８６．９７ ＃△１．８９±０．３１ ＃△
Ｂ组（ｎ＝８） ８８．１９±１０．２９ ＃☆３１０．２９±５９．３８ ＃☆１．３２±０．２３ ＃☆
Ｃ组（ｎ＝９） ６２．５８±９．１２ ＃△☆▲１６８．９５±２９．７４ ＃△☆▲１．０１±０．２２ ＃△☆▲
注：与ＮＣ组比较， Ｐ＜０．０１；与ＭＣ组比较，＃Ｐ＜０．０１；与ＰＣ组比较，△Ｐ＜０．０１；与Ａ组比较，☆Ｐ＜０．０１；与Ｂ组比较，▲Ｐ＜０．０１
２．２ ６组大鼠心肌组织病理变化 ＮＣ组大鼠心肌组织细胞均匀分布、纤维条理清晰、呈长梭形；ＭＣ组心肌细胞肿胀变形、甚至破裂，大量细胞核固缩深染，心肌纤维严重紊乱、变形；Ａ组心肌细胞肿胀变形，部分细胞核固缩深染，心肌纤维有明显紊乱、变形；ＰＣ组和Ｂ组部分心肌细胞肿胀变形，少量细胞核固缩深染，心肌纤维有紊乱、轻微变形；Ｃ组少量心肌细胞肿胀变形，较少细胞核固缩深染，心肌纤维有紊乱表现，大多呈长梭形且结构致密。见图１。
２．３ 干预后心肌细胞凋亡指数对比 干预后ＭＣ组心肌细胞ＡＩ高于ＮＣ组（Ｐ＜０．０１），ＰＣ组、Ａ组、Ｂ组、Ｃ组均低于ＭＣ组（Ｐ＜０．０１），ＰＣ组、Ｂ组和Ｃ组均低于Ａ组（Ｐ＜０．０１），Ｃ组均低于ＰＣ组和Ｂ组（Ｐ＜０．０１）。见图２，表２。
２．４ 干预后心肌组织ＴＬＲ４、ｐ３８ＭＡＰＫｍＲＮＡ表达对比 干预后ＭＣ组心肌组织ＴＬＲ４ｍＲＮＡ表达均高于ＮＣ组（Ｐ＜０．０１），ＰＣ组、Ａ组、Ｂ组、Ｃ组均低于ＭＣ组（Ｐ＜０．０１），ＰＣ组、Ｂ组和Ｃ组均低于Ａ组（Ｐ＜０．０１），Ｃ组均低于ＰＣ组和Ｂ组（Ｐ＜０
．０１）。６组ｐ３８ＭＡＰＫｍＲＮＡ表达对比差异均无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。见表３。
２．５ 干预后心肌组织ＴＬＲ４、ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表达及ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ水平对比 干预后ＭＣ组心肌组织ＴＬＲ４蛋白表达、ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ水平均高于ＮＣ组（Ｐ＜０．０１），ＰＣ
图１ ６组大鼠心肌组织纵切面病理变化（ＨＥ×４００ttg
）
图２ ６组心肌细胞ＡＩ检测（ＴＵＮＥＬ×１００）
表２ 干预后心肌细胞凋亡率比较
％，珋ｘ±ｓ组别心肌细胞凋亡率ＮＣ组（ｎ＝９）１．５６±０．３１
ＭＣ组（ｎ＝８）４２．５３±５．１８ ＰＣ组（ｎ＝８）２０．２０±３．４２ ＃Ａ组（ｎ＝８） ２８．０２±４．２６ ＃△Ｂ组（ｎ＝８） ２０．０７±３．５５ ＃☆Ｃ组（ｎ＝９）
１１．３６±２．０７
＃△☆▲ 注：与ＮＣ组比较， Ｐ＜０．０１；与ＭＣ组比较，＃Ｐ＜０．０１；与ＰＣ组比较，△Ｐ＜０．０１；与Ａ组比较，☆Ｐ＜０．０１；与Ｂ组比较，▲Ｐ＜０．０１
组、Ａ组、Ｂ组、Ｃ组均低于ＭＣ组（Ｐ＜０．０１），ＰＣ组、Ｂ组和Ｃ组均低于Ａ组（Ｐ＜０．０１），Ｃ组均低于ＰＣ组和Ｂ组（Ｐ＜０．０１）。各组ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表达对比差异均无统计学意义（
暖通空调系统
Ｐ＞０．０５）。见表４，图３。表３ 干预后心肌组织ＴＬＲ４、ｐ３８ＭＡＰＫｍＲＮＡ表达比较珋
ｘ±ｓ组别ＴＬＲ４ｍＲＮＡｐ３８ＭＡＰＫｍＲＮＡＮＣ组（ｎ＝９）０．４８±０．０８
０．８９±０．１５
ＭＣ组（ｎ＝８）１．３６±０．１７ ０．９２±０．１７ ＰＣ组（ｎ＝８）０．８６±０．１２ ＃０
．９０±０．１６ ＃Ａ组（ｎ＝８） １．０１±０．１５ ＃△０．８８±０．１８ ＃△Ｂ组（ｎ＝８） ０．８８±０．１０ ＃☆０．９１±０．１７ ＃☆Ｃ组（ｎ＝９）
０．６０±０．０９
＃△☆▲０．９２±０．１６
＃△☆▲ 注：与ＮＣ组比较， Ｐ＜０．０１；与ＭＣ组比较，＃Ｐ＜０．０１；与ＰＣ组比较，△Ｐ＜０．０１；与Ａ组比较，☆Ｐ＜０．０１；与Ｂ组比较，▲Ｐ＜０．０１
３ 讨论
脓毒症早期多以炎性介质增加为基本改变，机体可释放大量的促炎性因子，包括ＴＮＦ α、白介素 ６、ＴＬＲ４等，而抗炎性因子如蛋白激酶Ｃ、白介素 ４等则
表４ 干预后心肌组织ＴＬＲ４、ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表达及ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ水平比较
珋
ｘ±ｓ组别ＴＬＲ４ｐ３８ＭＡＰＫｐ ｐ３８ＭＡＰＫＮＣ组（ｎ＝９）０．１２±０．０３
０．９６±０．１５０．０９±０．０３
ＭＣ组（ｎ＝８）０．９９±０．１４ ０．９２±０．１３１．２０±０．１４ ＰＣ组（ｎ＝８） ０．６１±０．１０ ＃０．９５±０．１４０．５９±０．１１ ＃Ａ组（ｎ＝８） ０．８０±０．１１ ＃△０．９４±０．１３０．７８±０．１２ ＃△Ｂ组（ｎ＝８） ０．５８±０．０９ ＃☆０．９２±０．１４０．５７±０．１０ ＃☆Ｃ组（ｎ＝９）
０．２３±０．０４
＃△☆▲０．９３±０．１５
０．２６±０．０６
＃△☆▲ 注：与ＮＣ组比较， Ｐ＜０．０１；与ＭＣ组比较，＃Ｐ＜０．０１；与ＰＣ组比较，△Ｐ＜０．０１；与Ａ组比较，☆Ｐ＜０．０１；与Ｂ组比较，▲Ｐ＜０．０
１
图３ 干预后６组心肌组织ＴＬＲ４、ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表达及ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ水
平检测（
ＷＢ）分泌较少，难以有效对抗炎性介质的作用，二者平衡被
打破，导致过度炎性反应［
９］
。研究指出，在脓毒症发生后，促炎性因子的大量释放可损伤血管内皮细胞，进
而造成心脏、肾脏等多个重要脏器功能损害［１０］
。ＴＮＦ
苏格拉底
α的大量合成和分泌可诱导Ｎ
Ｏ表达上调，并通过ＮＯ依赖途径介导心肌组织损伤［１１］
。因此在对脓毒症实施抗心肌损伤时应积极抗炎，纠正促炎性因子和抗炎性因子的平衡。
心肌组织中促炎因子含量是反映炎性反应程度的直接指标，同时也是评价炎性反应损伤情况的重要标志。本次研究中，干预后ＭＣ组心肌组织ＴＬＲ４、ＴＮＦ α
、ＮＯ含量均远高于ＮＣ组，ＰＣ组和３浓度组均较ＭＣ组下降，提示乌司他丁和毛蕊异黄酮均可减轻脓毒症大鼠心肌组织炎性损伤程度，且其作用呈浓度依赖性。在病理学观察结果中可见ＭＣ组心肌组织纤维、细胞均严重改变，ＰＣ组和３浓度组均有所减轻，且Ｃ组与ＮＣ组病理学表现最为接近，提示乌司他丁和毛蕊异黄酮均可减轻脓毒症大鼠的心肌组织病变，且高剂量毛蕊异黄酮的作用更佳。毛蕊异黄酮是黄芪的有效成分之一，黄芪具有益气复脉、活血化瘀、解毒祛瘀的功效，毛蕊异黄酮也被证实可促使心肌供血恢复，减轻缺
血诱导的炎性损伤［１２］。有研究发现，毛蕊异黄酮可清
除氧自由基、抗氧化应激损伤，还可调节促炎性因子和抗炎性因子的平衡，控制炎性反应对心肌组织造成的
损伤［１３］
。本研究还发现ＭＣ组心肌细胞ＡＩ显著高于
ＮＣ组，ＰＣ组和３浓度组心肌细胞ＡＩ则较ＭＣ组显著降低，且Ｃ组明显低于其余３组，提示毛蕊异黄酮可控制脓毒症大鼠心肌细胞凋亡，且高浓度的作用效果更佳。
功率因数调整电费办法 ＴＬＲｓ是炎性信号转导的门户蛋白，ＴＬＲ４激活可
持续诱导炎性反应，并协同ｐ３８ＭＡＰＫ参与脓毒症心肌损伤的病变过程。本研究ＴＬＲ４、ｐ３８ＭＡＰＫｍＲＮＡ与蛋白，ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ水平对比结果中显示，ＭＣ组ＴＬＲ４ｍＲＮＡ与蛋白，ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ水平相较于ＮＣ组均显著升高，
ＰＣ组和３浓度组相较于ＭＣ组显著下降，且Ｃ组明显低于其余３组，推测毛蕊异黄酮可能对脓毒症大鼠心肌组织ＴＬＲ４／ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路有调控作用。在一项脓毒症并心肌损伤发生机制的
实验研究中表明，ＴＬＲ４能对病原相关分子模式特异性识别，刺激信号转导，并且可介导促炎性介质的合成和释放，诱
发和加重心肌组织炎性损伤［１４］
家校网。而ｐ３８ＭＡＰＫ是其下
游重要的炎性反应调控指标，ＴＬＲ４被激活后可促进ｐ３８ＭＡＰＫ的磷酸化反应。ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ则可促进白细胞的聚集、活化，调节转录因子的活性，促进细胞因子的合成，并且还可调控炎性反应，通过一系列级联反应，最终可参与脓毒症介导的心肌损伤。国内外也有相关报道证实ＴＬＲ４／ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路的活化在脓毒症肺损伤、心肌损伤、肾损伤等疾病发生中均积极参
与［１５－１７］
，与此同时ＴＮＦ α
、ＮＯ水平增高，从而参与组织炎性反应损伤，表明在脓毒症中抑制ＴＬＲ４／ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路相关因子，下调ＴＬＲ４基因与蛋白表达，控制ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ水平对减轻多种脏器结构组织损伤具有重要的意义。有研究显示，毛蕊异黄酮可通过抗心肌细胞缺氧诱导的氧化应激和炎性反应从而减
轻大鼠心肌缺血再灌注损伤［１８］。另有报道指出，对老
年脓毒症大鼠予以参附注射液可减轻心肌损害，发挥心肌保护作用，且证实与抑制ＴＬＲ４的活性、控制
炎性因子水平有关［
１９］
。 综上所述，对脓毒症大鼠予以毛蕊异黄酮可减轻心肌组织炎性和病理损伤，减少心肌细胞凋亡，且在一定范围内用药浓度越高毛蕊异黄酮的作用越佳，推测与抑制ＴＬＲ４的活性，降低ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ水平有关，为临床用药的研究提供了新的方向。
参考文献
１ 喻文，罗红敏．联合生物标志物预测疑似脓毒症危重患者的急性病
死率．
中华危重病急救医学，２０１８，３０：６２８ ６３０．２ 马兴龙，王远方，杨阳，等．严重脓毒症患者临床特征及死亡预测因
素分析．广东医学，２０１７，３８：３４７２．
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