听障CRISPR/Cas9-based genome editing technology
A CRISPR/Cas9 vector system for multiplex targeting of gene sites in 萧振高中跳楼事件monocot plants
亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室
华南农业大学 生命科学学院
刘耀光课题组
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2 相关载体图谱
2.1 CRISPR/gRNA vectors (单子叶植物用) (sgRNA: single guide RNA,简称gRNA)：
注：用载体骨架长片段隔开神秘搭车人U3/U6启动子和gRNA区可避免未切断质粒被PCR扩增（短时延伸20秒)见后面）。这些质粒在E.coli DH10B繁殖。
2.2 CRISPR有机物除杂/Cas9双元载体(单子叶植物用)
pYLCRISPR/Cas9-MH，原命名pYLCRISPR/Cas9-MTmono (M=monocot; H=HPT，抗潮霉素基因) pYLCRISPR/Cas9-MB (B=Bar, 抗草苷膦基因)
本套载体系统的pCas9为本实验室设计合成的植物优化密码子基因。双元载体骨架（LB—RB非T-DNA序列）为pCAMBIA-1300(ACCESSION: AF234296)
与以前的载体相比，这2个载体改造了原来的融合型ccdB即LacZ/ccdB为ccdBs(shorten ccdB,即删除了LacZ序列)及其相对方向反过来，其它部分不变。
注： 这些质粒保存在 E. coli TOP10F’(LacIq) 菌株繁殖，以使ccdB(大肠杆菌致死基因)能够被LacIq 产生高水平阻碍蛋白抑制其表达。
3.1 靶位点选择
（1）在目标区如果能够到NGG上游第20碱基是A（用U3启动子）或G (用U6a~c启动子）的序列 (A，G分别为U3和U6启动子的转录起始碱基），优先选为靶序列
合成接头的形式（左：连接U3启动子；右：连接U6a启动子）
注意：接头正向引物F和反向R命名命名是根据靶点在gRNA表达盒的连接方向决定，不是基因方向决定，否则这些引物用于检测阳性克隆时容易搞错方向; 另外注意设计引物（尤其 反向引物）时的5’---3’方向。
（2） 如果在NGG上游第20碱基不是A或G，可选20碱基为靶序列（参考Kabin Xie and Yinong Yang， 2013， Molecular Plant)合成接头的形式
（连接U6a启动子）
也就是说，所用启动子的转录起始点与NGG上游第20碱基相同的靶点就是19碱基(19+A/G=20)，不相同的靶点就是20碱基。
（3）为了提高突变效率，可以对一个目的基因设计2个靶点(尤其只有一个靶基因)。建议在ORF 5’区和功能结构域各设计1个靶点，使之任何1个靶点的突变都可以产生功能缺失，或2个靶点之间的序列被敲除。靶点序列GC%偏高可提高打靶效率，因此靶点最好含有11-14个C/G（包括U6转录起始点G）。
几个靶位点设计例：
左图：切点在起始密码附近或尽量在ORF上游，或在特定的功能域 (可能引起密码子缺失和移码)
右图：切点在外显子末端或前端（可能引起移码，或内含子识别位点缺失使内含子不被剪切）
（4）靶点特异性检查：虽然对植物基因打靶的特异性不是重要的问题（万一产生有负面作用的非特异打靶，把突变体与原受体亲本杂交（和回交）就可分离排除非特异打靶位点），但应该将候选靶序列+NGG（上下游加几十碱基）对目标基因组做Blast (选Somewhat similar sequences (blastn)，避免在靶序列3’端+NGG与其它功能基因和基因组序列有相似性。但是打算用一个靶序列敲除2个或以上的同源基因时，就选择几个目标基因完全相同的区域为靶位点。
3.2 靶位点接头引物设计例
4. 多靶点pYLCRISPR/Cas9-MH (B)载体构建
4.1 gRNA表达盒构建示意图
4.2 靶点引物接头与gRNA表达盒的实际连接方式和扩增
为了提高接头连接效率，使用较高浓度（0.05-0.1 μM）的靶点接头，实际上大部分产生线性单端连接，而环状(双端)连接较少。另外，过度酶切，星活性，过度连接等可能产生破坏的平滑末端，有可能连接产生双接头产物或的空载产物（下图的产物IV和产物V）。连接接头后，有3种方法扩增gRNA表达盒片段：（1）直接用位置特异引物做一轮PCR扩增; （2）做2轮巢式PCR，第一轮PCR用通用的U-F/gRNA-R做1个反应，第二轮用位置特异引物扩增；（3）做2轮巢式PCR，第一轮PCR做2个反应，分别用U-F/接头反向引物，和用接头正向引物/gRNA-R；第二轮为Overlapping PCR,用位置特异引物扩增出表达盒产物。方法（1）效果不那么稳定，且不能避免扩增下图的产物IV和产物V。方法（2）的扩增效果好且稳定，但同样不能避免扩增产物IV和产物V。方法（3）虽然第一轮PCR需要做2个反应，但效果最好且能避免扩增产物IV和产物V，因此推荐使用方法（3）。下图为方法（3）示意图。关敏卿
在第一轮PCR加热过程中（73-75度），有缺口的引物（Tm值低于U3/6和gRNA序列）先解离， U3/6和gRNA序列3’端（未解离）立即延伸补平，产生接头引物互补结合位点。
4.3 gRNA表达盒扩增引物
第一轮PCR扩增引物（所有gRNA表达盒共用）：
U-F: 5-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3; gRNA-R: 5-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3
第二轮PCR扩增引物（使用策略I Golden Gate ligation的位置特异gRNA表达盒专用）：
（B1’, B2, B2’, B3, B3’等表示各连接点位置； ctcg, tcag等表示Bsa I 切点粘性末端的正链序列;相同颜的BsaI切点粘性末端是可特异配对连接的互补末端）
靶点1（T1）： SpeI
（new）Uctcg-B1’: TTCAGAggtctcTctcgACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3（U3/6上游引物）
gRctga-B2: AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3（第二轮gRNA下游引物）
T2:
Uctga-B2’: TTCAGAggtctcTctga哈卡斯人CACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
gRaaga-B3: AGCGTGggtctcGtcttGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3
T3:
Uaaga-B3’: TTCAGAggtctcTaagaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
gRgact-B4: AGCGTGggtctcGagtcGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3
T4:
Ugact-B4’: TTCAGAggtctcTgactCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
gRggac-B5: AGCGTGggtctcGgtccGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3
T5:
Uggac-B5’: TTCAGAggtctcTggacCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
gRtctg-B6: AGCGTGggtctcGcagaGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3
T6:
Utctg-B6’: TTCAGAggtctcTtctgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
gRaggt-B7: AGCGTGggtctcGacctGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3
T7:
Uaggt-B7’: TTCAGAggtctcTaggtCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
gRcgct-B8: AGCGTGggtctcGagcgGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3
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