应用体外DNA同源重组技术构建pcDNA3.1-NGF和pcDNA3.1-TrkA

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张严;龚爱华;金洁;邵根宝;彭琬昕

pcboost【摘要】目的:利用体外DNA 同源重组的方法分别构建含神经生长因子(NGF)和神经生长因子受体(TrkA)基因的真核表达载体.方法:在引物5′加上一段与载体克隆位点两端碱基序列相同的序列,PCR扩增目的基因NGF和TrkA,线性载体片段和目的基因片段经T4 DNA 聚合酶的外切产生互补的单链DNA,然后37℃退火实现体外同源重组,转化并鉴定;将重组质粒转染293A细胞,免疫印迹鉴定目的基因的表达情况.结果:成功构建真核载体pcDNA3.1-NGF和pcDNA3.1-TrkA,转染细胞后的表达产物相对分子质量分别是31×103和140×103.结论:与常规重组技术相比,体外DNA 同源重组技术是一种高效的DNA 重组方法,且不需考虑目的片段的限制性酶切位点.%Objective: In this study, we use the DNA homologous recombination in vitro to construct NGF and tyrosine kinase A (TrkA) eukaryotic expression vector. Methods: PCR primers for inserts were designed to contain appropriate 5' extension sequences. For the cloning reaction we generated the vector by cleavage with double restriction enzyme and generated the inserts TrkA and NGF by PCR. We treated both the vector and the inserts wit

地源热泵换热h T4 DNA polymerase to generate overhangs, then incubated vector and insert to promote recombination, and transformed the products into E. Coli and identified. Transfect the recombination DNA into 293A and identify the gene expression. Results: The expression vector pcDNA3. 1-NGF and pcDNA3.1-TrkA were constructed successfully by homologous recombination. Western blot showed TrkA protein expression in infected 293A cells was 140 x 103 and NGF was 31 x 103. Conclusion: Compared with conventional recombination technology, homologous recombination in vitro was a kind of high efficient DNA recombination method, and with no need for considering the restriction enzymes' site.

【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》

【年(卷),期】2011(021)005

【总页数】5页(P390-393,401)

【关键词】体外DNA;同源重组;TrkA;神经生长因子;T4 DNA;聚合酶

【作者】张严;龚爱华;金洁;邵根宝;彭琬昕

【作者单位】江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013

【正文语种】中文

【中图分类】R393

李纳斯基于限制性内切酶的DNA重组技术是20世纪最具卓越成就的生物学技术之一［1］。通常的DNA重组方法需要选择合适的限制性酶切位点和黏性末端或平头末端［2］。然而，在一些重组反应中，很难到合适的可以利用的限制酶切位点。尽管目前已有一些方法可以用来解决这个问题，如通过定点突变来产生新的限制酶切位点［3］或通过接头来对目的片段进行准确的扩增［4］，但是，这些方法或很昂贵或需要额外的遗传操作，应用受到很大的限制。本研究在参考相关文献的基础上，利用实验室常规DNA重组反应体系，依据同源

序列碱基互补形成双链的原理，通过T4DNA聚合酶外切目的基因片段与载体片段而产生互补的单链DNA，退火后实现同源重组。

神经生长因子(nerve growth factor，NGF)一般通过信号转导途径影响细胞的生长、增殖、分化等生命活动［5］。NGF与其表面高亲和力受体(TrkA)结合后，TrkA磷酸化，活化后的pTrkA继而在细胞内启动一系列信号通路，如MAPK、AKT等。然而，在上述经典的第二信号转导通路之外，近年来国外学者发现NGF及其受体还可以通过“信号化内体(signalling endosome)”调控细胞的相关生命活动［6-7］，也就是 NGF可促进 pTrkA的内吞，在细胞内形成含有活化的TrkA的内体，该内体在移近细胞核过程中产生相应的细胞生物学效应。前期研究发现神经生长因子受体TrkA(原癌基因trk的产物)在人脑胶质瘤组织及细胞株中有核转位现象［8］，这与细胞恶性增殖有关，可能也是肿瘤细胞产生耐药性的原因之一。然而，TrkA核转位途径及其在核内的作用机制尚不清楚。本研究旨在利用同源重组法构建真核表达载体 pcDNA3.1-NGF和 pcDNA3.1-TrkA，为研究TrkA的作用机制奠定基础。飞虎续集

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1 材料和方法

1.1 材料

人胚肾细胞293A细胞株于本实验室保存，pcDNA3.1由基础医学实验室提供，pcDNA3.0-TrkA、pcDNA3.0-NGF 由本实验室构建保存，pGM-T载体购自Tiangen公司，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，HindⅢ、XhoⅠ、T4DNA聚合酶购自Fermentas公司，Taq DNA聚合酶购自TransGen Biotech公司，DNA标准参照物购自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 TrkA与NGF的引物设计选择载体pcDNA3.1上的XhoⅠ 和HindⅢ 两个酶切位点，依据这两种酶做双酶切后产生线性DNA两端的碱基序列设计目的基因的引物，使目的基因末端具有与载体相同的20 bp同源序列。引物由上海生工生物工程公司合成。TrkA上游引物P1：5'-ACG GGC CCT CTA GAC TCG AG A TGC TGC GAG GCG GAC GG-3'，下游引物 P2：5'-TTT TTG TTC GGG CCC AAG CTT GCC CAG GAC ATC CAG GTA-3'。NGF 上游引物 P3：5'-ACG GGC CCT CTA GAC TCG AG A TGT CCA TGT TGT TCT AC-3'，下游引物 P4：5'-TTT TTG TTC GGG CCC AAG CT T GGC TCT TCT CAC AGC CTT-3'(划线部分为同源序列)。

1.2.2 目的基因扩增及产物纯化

1.2.2.1 目的基因扩增目的基因TrkA以质粒pcDNA3.0-TrkA为模板，用引物P1、P2进行PCR扩增，反应条件：95℃ 5 min预变性，94℃ 45 s，65℃45 s，72℃ 120 s，循环 30 次，72℃ 7 min，-20 ℃保存。目的基因NGF以质粒pcDNA3.0-NGF为模板，用引物P3、P4进行PCR扩增，反应条件：95℃ 5 min预变性，94 ℃ 45 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，循环30 次，72℃ 7 min，-20℃保存。

1.2.2.2 目的基因 PCR产物纯化 PCR产物用1%的琼脂糖电泳，切下所需要的片段收入EP管中，碎胶、溶胶。加入500 μl Tris饱和纯酚，涡旋震荡。12 000 r/min 4℃ 离心15 min。取上清，加入500 μl 氯仿-异戊醇(24∶1)，涡旋震荡。12 000 r/min 4℃ 离心5 min。取上清加入900 μl预冷无水乙醇、20 μl 3 mol/L的醋酸钠，颠倒混匀12 000 r/min 4℃ 离心15 min。弃上清，室温吹风干燥，加入20 μl双蒸水溶解。

1.2.3 双酶切重组、同源重组及鉴定

1.2.3.1 双酶切重组目的基因的PCR产物通过TA克隆方法装到pGM-T载体上，提取重组质粒，用XhoⅠ和HindⅢ分别双酶切重组质粒和表达载体pcDNA3.1，胶回收目的片段和载体片段，加入T4连接酶，4℃过夜连接，取连接产物转化涂板培养12 h后，挑菌落培养过夜，

小提质粒后酶切鉴定。

1.2.3.2 同源重组在两个无菌EP管中分别加入1 μg经XhoⅠ 和HindⅢ双酶切的pcDNA3.1载体片段和目的片段的PCR产物，0.5 U T4DNA聚合酶，4 μl T4缓冲液，加双蒸水补足至20 μl。于室温反应30 min，加2 μl 10 mmol/L的dNTP终止反应。在一新的无菌EP管中分别加入2 μl载体的外切产物和6 μl目的基因的外切产物，2 μl连接酶缓冲液，于37℃反应1 h。取连接产物转化涂板培养12 h后，挑菌落培养过夜，小提质粒后酶切鉴定。

1.2.4 pcDNA3.1-NGF 与 pcDNA3.1-TrkA 转染293A细胞人胚肾细胞293A用含10%FBS的DMEM，置于CO2培养箱培养。转染前1天，将细胞消化接种到培养皿或培养板中，细胞接种的数量应保证第2天转染时能达到80%～90% 的密度。转染时，按照说明书操作，准备两管相应体积的不含血清的DMEM，一管加入质粒，另一管加入转染试剂，两管液体逐步混匀，室温下静置15～20 min后，直接加入细胞培养皿或板中，6 h后更换培养液，48 h后提取细胞总蛋白，-70℃保存备用。

1.2.5 免疫印迹检测TrkA与NGF的蛋白表达蛋白样品以10%SDS-PAGE进行电泳，以300 mA恒流转膜1.5 h，PVDF膜以1%BSA室温封闭2 h，再以1∶500稀释的一抗孵育2 h，洗

膜后用1∶5 000稀释的HRP羊抗小鼠IgG抗体室温孵育1 h，洗膜，用ECL化学发光，在ChampGelTM系列全自动凝胶成像分析系统(Sage Creation公司)进行拍照。

2 结果

2.1 载体pcDNA3.1双酶切结果

用限制性内切酶XhoⅠ和HindⅢ双酶切质粒pcDNA3.1 ，结果表明，pcDNA3.1 双酶切后的条带大小约为5 353 bp，表明质粒pcDNA3.1已被成功双酶切(图1)。

图1 XhoⅠ 和HindⅢ 双酶切质粒pcDNA3.1电泳图Fig 1 Agarose gel electrophoresis of plasmid pcDNA3.1 digested with Xho I and HindⅢ

2.2 同源重组 pcDNA3.1-TrkA/NGF连接质粒双酶切鉴定

挑单克隆接种于3 ml含氨苄西林(AMP)的LB培养基中，37℃ 震荡培养12～16 h。收集菌体，提取质粒。用XhoⅠ、HindⅢ 双酶切质粒，取反应产物做琼脂糖凝胶电泳。结果表明，体外DNA同源重组pcDNA3.1-NGF连接的质粒与用TA克隆方法构建的质粒大小相同;且用X

hoⅠ 和HindⅢ 双酶切质粒，产生大小分别为5 353 bp和760 bp的两个片段(图2)，表明目的基因NGF已成功地装配到pcDNA3.1 载体上。

同源重组的质粒pcDNA3.1-TrkA与用TA克隆法构建的质粒大小相同;且用XhoⅠ 和HindⅢ 双酶切质粒，产生大小分别为5 353bp和2 418bp的两个片段(图3)，表明目的基因TrkA已成功地装配到pcDNA3.1 载体上。

图2 pcDNA3.1-NGF质粒双酶切鉴定Fig 2 Identification of homologous recombinant plasmid pcDNA3.1-NGF digested with XhoⅠand Hind Ⅲ

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