实时荧光定量PCR是在常规PCR基础上发展起来的定量PCR技术，通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积，实时监测整个PCR进程，最后根据ct值和标准曲线，对未知模版进行定量分析。常用的实时荧光定量PCR又分为非特异性荧光标记的SYBR Green法和特异性荧光标记的TaqMan法和分子信标法。 一、实时荧光定量PCR原理： 1、SYBR Green法： SYBR Green是一种双链DNA结合染料，游离状态下不发光，非特意地掺入到双链DNA中后发出荧光信号，其强度与双链DNA的数量相关，随着扩增产物量的增加，检测到的荧光信号增强。 2、TaqMan法： 在扩增反应液中，加入一特异性探针，该探针5‘端和3’端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，两基团位置靠近，5‘端报告基团的荧光能量被3’端淬灭基团吸收，此时检测不到荧光信号，在扩增过程中，探针与模板结合形成Taq酶的5‘ →3’外切活性底物，当Taq酶沿模板向前延伸到探针结合处时，发生链的置换，Taq酶的5’→3’外切活切将探针5‘端连接的报告基团从探针上切割下来，5’端报告基团的荧光能量脱离3’端荧光淬灭基团的吸收，可检测到荧光信号，每经过一个PCR循环，荧光信号也和扩增产物一样，有一个同步增长的过程。 3、分子信标法： 探针设计成茎环结构的发夹状，环部核苷酸序列与扩增产物序列互补，两端核苷酸序列互补形成茎部，且一端标记有报告基团，另一端标记有淬灭基团，探针未与模板结合时，报告基团和淬灭基团空间位置靠近，报告基团的荧光能量被淬灭基团吸收，此时，检测不到荧光信号，与模板结合后，探针的构象由发夹状改变为链状，报告基团和淬灭基团分离，可检测到荧光信号。 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。 流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA建设项目环境保护分类管理名录互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。 RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。 二、试剂 器材 设备和器械 咽拭子液的配制：一瓶MEM液500ml，+8万单位庆大1.25ml，分装在5ml小管中，每管4ml。小管最好高压。 1、RNA提取试剂盒 荧光PCR检测试剂盒 提取试剂盒组分：洗脱液（Elution Buffer）、载体核酸（Carrier RNA）、裂解结合增强液（Lysis/Binding Enhance）、裂解/结合液（阿魏酸Lysis/Binding Soln）、磁珠（RNA Binding Beads）、洗涤液1（Wash Soln 1）、洗涤液2（Wash Soln 2） 荧光PCR检测试剂盒组分：2×RT-PCR反应液（2×RT-PCR Buffer）、25×RT-PCR酶混合液（25×RT-PCR Enzyme Mix）、高G/C含量引物/探针检测增强剂 （Detection Enhancer）、无核酸降解酶的水（Nuclease-free Water） 无水乙醇 无水异丙醇 三、操作步骤 一．样本的处理 （在样本处理区进行） 根据咽拭子标本数，计算好所需配制的裂解液和磁珠混合液的量，即待测样本数+阴性对照+甲型对照+乙型对照+ 一个样本量为损耗。需要配制的液体仅仅是洗液：洗液1：向Wash Soln Conc. 1瓶中加入12毫升无水异丙醇（100%）。摇匀后室温保存；洗液2：向Wash Soln Conc. 2瓶中加入32毫升无水乙醇（100%）。摇匀后室温保存。将含拭子的转运液震荡2分钟，取50微升上清液进行核酸抽提。剩余溶液-80℃保存。 1. 配制裂解/结合液 每反应1ul Carrier RNA，每反应65ul Lysis/Binging Conc.,每反应65ul 无水异丙醇。摇匀后室温保存备用。 2. 配制磁珠混合液 每反应10ul Lysis/Binging Enhance，每反应10ul RNA binding Beads。混匀后4℃保存备用。 3. 裂解/ 结合 U型板中顺次加入20ul磁珠混合液、50ul预处理后的样品、130ul裂解/ 结合液。漩涡振荡器上轻微振荡5分钟，完成溶液混匀和核酸结合。将U型板移至96孔磁力板上，静置3分钟。将U型板保持在磁力板上，移去上清液。 4. 洗涤液1洗涤2次： 将U型板从磁力板上拿下，加入150微升洗涤液1，漩涡振荡30秒 将U型板移至96孔磁力板上，静置2分钟。将U型板保持在磁力板上，移去上清液 用150微升洗涤液1再洗涤一次。尽量吸干上清液。 5. 洗涤液2洗涤2次 将U型板从磁力板上拿下，加入150微升洗涤液2，漩涡振荡30秒 将U型板移至96孔磁力板上，静置1分钟。将U型板保持在磁力板上，移去上清液 用150微升洗涤液2再洗涤一次。尽量吸干上清液 6. 洗脱 将U型板从磁力板上拿下，漩涡振荡2分钟让剩余溶液挥发。 加入50微升Elution Buffer, 漩涡振荡3分钟。 将U型板移至96孔磁力板上，静置4分钟。纯化的核酸在上清液中，可直接用于PCR或转入干净的离心管中-20℃ 储存。 二．扩增试剂准备与配置 （在反应混合物配制区进行） 1、引物介绍（不全，待续）：
2、甲型H1N1流感病毒及其它流感病毒Real-time PCR引物和探针稀释方法： 1．引物工作浓度（40μM） 配制方法： （1）将新合成的引物开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。 （奥特朗托城堡2）用RNase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100μM，可作为储存液。 （例如：假设合成引物每管2OD，若1OD的量为4.75 nmol （0.00475μmol），则一管引物的总摩尔数为2×4.75=9.5nmol，加水量为10×9.5＝95μl） （游园记3）将100μM的引物2.5倍稀释，此时浓度为40μM，可作为工作浓度。 2．探针工作浓度（20μM） 配制方法： （1）将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。 （2）用RNase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100μM，可作为储存液。 （3）将100μM的探针5倍稀释，此时浓度为20μM，可作为工作浓度。 以上配制仅仅是我们工作中常用的配制具体配制的关键是：注意各引物管实际所标记的OD数，以及各型引物探针规定的工作浓度。此为09年下发的引物探针：
溶解前4℃保存，溶解后-20℃或以下保存。 3、反应体系的配制： 桦川一中 试剂盒中取出所需试剂，在室温下融化后，4000r/min离心30s，配制反应体系： 无RNA酶水（Rnase Free Water) 每反应5μl 2×RT-PCR Buffer 每反应12.5μl 上游引物 每反应0.5μl 下游引物 每反应0.5μl 探针 每反应0.5μl 25×RT-PCR Enzyme Mix 每反应1μl 充分混合均匀，向每个PCR管（指定仪器专用）中每支各分20ul，转移至样本处理区。 三．加样 （在样本处理区进行） 领回的阳性RNA-20℃保存，5倍稀释使用。 在各设定的PCR管（指定仪器专用）中每支分别加入提取的样品RNA溶液以及阴、阳性对照各5ul，盖紧管盖后，4000r/min离心30s。 四．荧光RT-PCR反应 （在检测区进行） 1．将装有反应体系和样品RNA的PCR反应管放入荧光PCR检测仪内 2．循环条件设置 a) _50_℃ __30__min b) _95_℃ __10__min c) _95_℃ __15__sec d) _55_℃ _31__sec (注：荧光收集设置在此步进行) e) 从第c)步（_95_℃ __15__Sec）开始循环__44___周期 五.结果判定 1.结果分析条件设定 反应结束后，自动保存检测数据文件，调节噪音基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，读取结果。 2．结果描述及判定原则 在质控标准有效地情况下进行结果判断：阴性对照的检测结果阴性；阳性对照的Ct值≤28.0。否则此次实验视为无效。 根据Ct值判断结果，Ct值无数值的样本为阴性样本。Ct值≤40.0的样本为阳性样本； Ct值＞37.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。 六、输入新程序： 生成程序文件程序文件包含一个程序，这个程序控制热循环仪运行参数，定制什么时候Opticon 2检测器对分配有样品、定量标准及空白孔中的荧光进行测定。程序的步骤可以在程序文件窗口中进行输入和编辑，并有一个列表和一个简图来显示各个步骤。按主文件中Protocol Setup一节的New按纽可以生成一个新的程序文件。 选择温度和热盖控制模式点击温度和热盖模式一栏的Set Modes(设定模式)按纽，来显示热盖模式窗口，你可以定制运行时所使用的温度控制方法（Control Method）及热盖控制(Lid Control)方法。 温度控制方法DNA Engine Opticon 2可用两种不同的方法来控制模块的温度，每一种方法可会影响样品加热的速度和精确度。 1、计算控制是默认的温度控制方式。它是大多数程序所选用的方式，它一致性好，快速而且可靠。在使用计算控制方式时，DNA Engine Opticon 2根据模板的温度、样品管的传热速度以及样品的体积来估计样品的温度。由于这一估计是基于已知量及热传导的规则，因此样品温度的控制比模块温度控制方式更精确。 使用计算控制方式可以明显缩短程序运行的时间。此外，还有利于保持酶的活性及降低引物错配。在计算控制方式下，变性时间一般为5-30秒，复性和延伸温度也可以减少，但其时间长短因反应的不同而不同。 计算控制方式通过以下三个方面来缩短程序： ?8?5 通过短而精确的模板温度过高来快速地提高样品温度 ?8?5 根据样品而不是模块达到目的温度的时间来确定保温时间 ?8?5 仪器根据容器的型号及反应液的体积来自动进行补偿 2、在模块控制方式中，DNA Engine Opticon 2系统根据程序来控制模块的温度，而不是样品的温度。在控制样品实际温度方面，模块控制方式的精确性比计算控制方式要差。在模块控制方式中，样品温度始终落后于模块的温度。落后时间的长短与容器的型号及反应液的体积有关，一般在10-30秒之间。模块控制方式一般用于运行由其他模块控制方式的热循环仪得来的程序，如MJ Research公司的PTC-100循环仪及PTC-150型循环仪。 热盖控制当样品被加热后，水汽会向上蒸发，积到管盖或平板盖上。这会造成样品体积、反应物浓度以及酶学反应动力学的改变。使用热盖可以使反应容器上部的温度比反应液温度高，从而减少水份的蒸发。DNA Engine Opticon 2系统有三种控制热盖的方式：Constant(恒定)、Tracking(追踪)或Off(关闭)。 ?8?5 Constant(恒定)：维持热盖一个特定的温度。要使用恒定热盖温度控制方式，可选择Constant(恒定)，并输入30度到110度之间的一个温度或用箭头滚到想要的温度。一般推荐比程序中最高温度高5-15度。你还可以设定一个样品-模块温度，当热盖温度低于此温度时，热盖就会关闭。在Lid Shutoff Temperature(热盖关闭温度)中输入一个1度至50度的温度，或用箭头滚到想要的温度。 ?8?5 Tracking(追踪)：设定热盖的温度比样品模块的温度略高。这一方式对于在30-70度之间长时间保温的程序来讲是有用的，从而不必将热盖温度一直保持在较高的温度下。一般设定比模块的温度高5度。要使用恒定追踪温度控制方式，可选择Tracking(追踪)，在Lid Temperature=Block Temperature +(热盖温度=模块温度+)一栏中输入1度到45度之间的一个温度，使得热盖温度保持比模块温度高。要定制样品-模板温度低于一定温度时，热盖自动关闭，可在Lid Shutoff(热盖并闭)中输入1-50度之间的一个温度或用鼠标箭头来滚动选择。 注意：由于热盖没有降温的能力，因此在模块温度变化较快时，热盖温度的变化是跟不上模块的。由于热盖质量较大，其加热的速度也比模块要慢。 ?8?5 Off（关闭）：不给热盖提供电源。在这模式中，样品会发生浓缩，其速率与保温的温度及所用的管或板的密闭剂类型相关。只有在使用油或石蜡封口时才能使用此选项。 点击OK将温度和热盖控制的设定应用到程序中，也可选Cancel(取消)来关闭此窗口而不改变程序所用的设定。这一设定将出现在程序列表和图形显示上方的Control and Lid Settings区域中。设计和输入程序本节将举一个程序的例子并介绍如何输入程序的步骤，另外还介绍程序的选项。举例如下： 1、94度保温30秒； 2、复性温度为温度梯度，在12列中从55度到65度； 3、读空白、定量标准及样品孔的荧光强度； 4、72度保温一分钟； 5、重复1-4的步骤，增加24次，然后进入第6步； 6、通过解链曲线来检测反应产物的纯度，具体步骤为：从55度升温到90度，温度每升高1度，测定荧光强度10秒； 7、结束程序 输入新程序： 当你向程序中输入一个步骤后，该步骤的描述就会出现在上部的程序显示窗口中，同时下部也会出现一个图示来说明此步骤的温度和时间。使用水平缩放滑块和滚动条可更清楚地观看程序简图。在输入一个新程序前，可以看到显示窗口上方有一个加深了的END（结束）步骤。Opticon 2监控软件中，所加入的步骤都在加深了的步骤之前。 温度步骤温度步骤确定保温的温度和时间长短。如果不在程序中另处设定升降温的速度，DNA Engine Opticon 2系统将以最快的速度达到此温度（参见本节最后的”Manual Ramp Rate”）。点击Temperature(温度)按纽进入保温步骤（如举例中的第1步和第4步）。 在Set Temperature to(设定温度为)一栏中输入一个0-105度之间的温度，也可用滚动条来选择，如例子中的第一步是94度。在Maintain For(保温时间)一栏中输入保温时间，最长可到18小时。点击时：分：秒并输入一个时间，也可用滚动条来选择，如例子中第一步的00：00：30。.你也可以选择Forever（永久）来将样品保存在某一温度下自定义的一段时间。一般用于程序完成后将样品保存在较低温度中，推荐为10度。在简图中永久保存表示为∞。 如不再作修改，点击Insert(插入)，将温度步骤加到程序中。此步骤立即在上部的程序显示窗口和下部的简图中出现。注意，此时加黑的步骤又是END，这表明，下一个插入的步骤是在END之前，第一步之后。在将步骤插入到程序中之前，你还可以通过选项来对温度步骤进行修饰，可修饰的选项包括： 1、Manual Ramp Rate(升降温速率)：设定一个比最高速率低的升降温速率。可在0.1-2.5度每秒之间进行设定。保温步骤之间的快速升降温可以节约总的反应时间10％-30％，并有利于降低非特异性扩增产物。 2、Increment Temperature(增加或降低温度)：修改温度步骤，使得每个循环增加或降低一定的温度（0.1-10度/循环）。这一办法一般用于复性这一步。 在复性时，复性温度从比计算的温度高一些开始，然后每个循环逐步降低，达到甚至低于计算温度。这种复性温度由高到低的策略有利于在循环早期得到较理想的扩增产物。 3、Extend Time(延长或缩短时间)：修改温度步骤，使得每个循环延长或缩短保温时间（1-60秒/循环）。 此方法一般用于延伸步骤中慢慢增加延伸时间（一般为2-5秒/循环）。在反应的最后几个循环中，由于酶活性的减少和模板分子数的增加，在延伸期间，每个酶分子所在合成的碱基数量大大增加，因此延长延伸时间有利用延伸更完全。 4、Beep When Completed(完成时发出嘟嘟声)：当目的温度达到时，机器发出嘟嘟声。梯度步骤温度梯度功能可以使你同时优化几个不同变性或复性温度。从左到右，96孔样品模块的温度可以相差1度至24度。最高的温度为105度，最低可为30度。点击Gradient(梯度)按纽可在程序中插入一个梯度步骤。 最左边一列（Column 1）是温度梯度的低温，其设定值应在30-104度之间。在我们例子中，Set temperature to 一栏中，L=55。最右边一列（Column 12）是温度梯度的高温，其设定值应在31-105度之间。在我们例子中，R=65。最左边一列与最右边一列的最小温差为1度，最大为24度。在输入完温度梯度的范围之后，还要在Maintain for(保温时间)一栏中输入保温时间。可以通过点击时：分：秒并输入一个时间，也可用滚动条来选择，如例子中的第二步的00：00：30度。.你也可以选择Forever（永久）来将样品保存在某一温度下自定义的一段时间。 如果不再作修改，点击Insert(插入)，将步骤加到程序中。梯度步骤将在程序显示窗口中显示为第2步。注意，此时加黑的步骤又是END，这表明，下一个插入的步骤是在END之前，第2步之后。在将梯度步骤插入程序中之间，你还可以选择Extend Time选项（参见”温度”一节对这些选项的解释）。梯度计算器要了解梯度保温时每一列精确的温度，可点击Tool（工具）菜单，并选择Gradient Calculator(梯度计算器)。 请注意温度梯度并不是线性的，中间孔的温度间隔较大。这是模块下的加热器的结构造成的。每个孔的温度都非常精确。温度梯度所得到的结果可以在随后的非梯度程序中得到很好的结果。读板步骤插入一个读板步骤可以指示Opticon 2检测器对样品、定量标准及空白孔进行荧光测定。读板在上一个保温步骤完成之后立即进行，如举例中的第2步。读板在当前的保温温度下完成，然后才开始下一步，如举例中的第4步。要插入一个读板步骤，请点击Plate Read(读板)按纽，读板步骤就会插入到程序中。在我们例子中，读板步骤显示为第3步，在简图中，读板用一个眼型的图标来表示。 增加多个温度步骤、梯度步骤和读板步骤要增加多个温度步骤、梯度步骤和读板步骤，可按适当的按纽，并按照以下步骤的指导进行。在我们的例子中，第4步是72度保温00:01:00，没有其他选项。循环步骤循环步骤的目的是让许多重复的步骤不必一步一步的输入和显示。当程序运行到循环步骤时，程序又回到指定的某一步，并运行这一步到循环步骤之间所有步骤。当循环进行了指定的次数之后，程序进行到循环步骤的下一步。在我们的举例中，第5步是回到第1步的循环步骤。再重复第1-4步24次，总共是25次，然后进行第6步。这些都包含在了一个循环步骤之中。 点击Goto(循环)按纽，输入程序返回的步骤号。在我们的例子中，Goto栏中输入的是1，How Many More Times?一栏中输入的是24。这个第5步将指导程序在进入第6步之前，重复1-4步共24次。点击Insert(插入)按纽，将循环步骤加入程序中去。 解链曲线步骤： 解链曲线可用来确定特定的片段以及分析产物的均一性。解链曲线图受到很多因素的影响，其中包括产物的数量和浓度、片段的长度和G+C含量以及其他一些影响核酸变性温度的因素，如缓冲液等。要进行解链曲线步骤，可点击Melting Curve(解链曲线)按纽。 输入一个Starting Temperature(开始温度)（0.0-99.0度），以及一个Ending Temperature(结束温度)（1.0-100.0度）。在我们的例子中，开始和结束温度分别为55度和90度。另外，还要在进行解链曲线步骤期间，让Opticon 2检测测定荧光强度。通过Temperature Increment Between Reads一栏输入一个温度（0.1-10.0度）来确定温度每升高多少度进行一次读板，通过在Hold Time Between Reads一栏输入一个时间（1秒-1小时）来确定读板期间，这一期间，温度要保持恒定。一般推荐温度每上升0.2度读板一次，读板期间为1秒。点击Insert（插入）按纽将解链曲线步骤增加到程序中。每个程序中只能有一个解链曲线步骤。 编辑某一步骤要想编辑程序的某一步骤，首先点击程序显示窗口中的这一个步骤，使其加深，然后点击Edit Step（编辑步骤）按纽。此步骤的各种参数就会显示出来，修改成你想要的之后，点击pdscReplace(替换)按纽将编辑后的步骤加入程序中，也可点击Cancel(取消)按纽来取消这次编辑。删除某一步骤要想删除程序的某一步骤，首先点击程序显示窗口中的这一个步骤，使其加深，然后点击Delete（删除）按纽将此步骤从程序中删除。剩余的程序各步骤会自动重新编号。在已有步骤中插入一个步骤要想在已有步骤中插入一个步骤，首先在程序显示窗口中点击想要插入新步骤的后一个步骤，使其加深。所有加入的步骤都在此步骤之前。然后点击相应的按纽来插入你想插入的步骤。当你输完所有的程序文件参数之后，点击程序文件窗口左上角的OK按纽来保存程序文件，并回到主文件窗口。主文件的程序设计一节会显示程序的简图、总的读板次数、解链曲线以及大约的运行时间。点击Cancel（取消）按纽也可以不保存程序文件并回到主文件窗口。融解曲线分析融解曲线可用来鉴别特异性片段或评估样品的同质性。融解曲线图受到多种因素的影响，如片段的浓度与数量、每个片段的长度及G+C含量，还有其他因素如缓冲液的条件等都会影响核酸的融解温度。Opticon 2 可以自动完成融解曲线。这一分析可用于多种用途，包括恒温试验、区分片段大小，利用Opticon 2 的96个样品的能力来完成高通量的终点分析。要完成一个与循环无关的融解曲线分析，点击Melting Curve 按纽。 输入一个Starting Temperature(开始温度)（0.0-99.0度），以及一个Ending Temperature(结束温度)（1.0-100.0度）。另外，还要在进行解链曲线步骤期间，让Opticon 2检测测定荧光强度。通过Temperature Increment Between Reads一栏输入一个温度（0.1-10.0度）来确定温度每升高多少度进行一次读板，通过在Hold Time Between Reads一栏输入一个时间（1秒-1小时）来确定读板期间，这一期间，温度要保持恒定。一般推荐温度每上升0.2度读板一次，读板期间为1秒。 点击Insert 按纽来增加一个融解曲线步骤到程序中。每个程序只能有一个融解曲线分析步骤。 保存一个程序文件要保存一个新生成的程序文件，从主文件窗口的程序设计一节中选Save按纽。在保存窗口的File name一栏中输入一个合适的名字。点击Save按纽就可保存为.prot文件了。 当然仅仅这些是远远不够的，还需要做的事情还有很多...以上总结仅仅适合我们的试剂和仪器。仪器使用说明见附件 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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