1.根据实验需要，确定需要扩增的DNA序列，并知道其CDS区序列（编码结构基因区，即从起始密码子区至终止密码子区）ncbi网站查询 RBS149..153
/gene="eryF"
CDS158..1372
/gene="eryF"
1ggatcccgat cgtgtcggag gaagaggcca agtcgcgccg ccccgaccag ctgctggtgc
61tgccctggat ctaccgcgac gggttcgtcg aacgcgagca ggagttcctc gctggcggcg
121gaaagctgat cttcccccta ccccgactgg aagtcgtatg acgaccgttc ccgatctcga
181aagcgactcc ttccacgtcg actggtaccg cacctacgcc gagctgcgcg agaccgcgcc
241ggtgacgccg gtgcgcttcc tcggccagga cgcgtggctg gtcaccggct acgacgaggc
301gaaggccgcg ctgagcgacc tgcgcctgag cagcgacccg aagaagaagt acccgggcgt
361ggaggtcgag ttcccggcat acctcggttt ccccgaggac gtgcggaact acttcgccac
421caacatgggc accagcgacc cgccgaccca cacccggctg cgcaagctgg tgtcgcagga
481gttcaccgtc cgccgcgtgg aggcgatgcg gccccgcgtc gagcagatca ccgcggagct
541gctcgacgag gtgggcgact ccggcgtggt cgacatcgtc gaccgcttcg cccacccgct
601gcccatcaag gtcatctgcg agctgctcgg cgtcgacgag aagtaccgcg gggagttcgg
换命快递661gcggtggagc tcggagatcc tggtcatgga cccggagcgg gccgaacagc gcgggcaggc
721ggccagggag gtcgtcaact tcatcctcga cctggtcgag cgccgccgca ccgagcccgg
781cgacgacctg ctgtccgcgc tgatcagggt ccaggacgac gatgacggtc ggctcagcgc
841cgacgagctg acctccatcg cgctggtgct gctgctggcc ggtttcgagg cgtcggtgag
901cctcatcggg atcggcacct acctgctgct cacccacccg gaccagctcg cgctggtgcg 961gcgggacccg tcggcgctgc
ccaacgccgt cgaggagatc ctgcgctaca tcgctccgcc 1021ggagaccacc acgcgcttcg ccgcggagga ggtggagatc ggcggtgtcg cgatccccca 1081gtacagcacg gtgctggtcg cgaacggcgc ggccaaccgc gacccgaagc agttcccgga 1141cccccaccgc ttcgacgtca cccgcgacac ccgcggccac ctgtcgttcg ggcagggcat 1201ccacttctgc atgggccggc cgctggccaa gctggagggc gaggtggcgc tgcgggcgct 1261gttcggccgc ttccccgctc tgtcgctggg aatcgacgcc gacgacgtgg tgtggcggcg 1321ttcgctgctg ctgcggggca tcgaccacct accggtgcgg ctcgacggat gagcacctgg 1381ctgcggcggt tcggtcctcc cgtcgagcac cgggcgcggc tggtgtgctt cccgcacgcg 1441ggagccgcgg ccgactccta cctcgacctc gcgcgcgcct tggcgcccga gatcgacgtg 1501cacgccgtgc agtacccggg gcgccaggac cgccgcgacg aggagcccct gggcaccgcc 1561ggcgagatcg ccgacgaggt ggccgccgtg ctgcgcgcgt cgggcggcga cggcccgttc 1621gccctgttcg ggcacagcat gggcgcgttg atcgcctacg agacggcgcg caggctcgaa 1681cgcgagcccg gcggcgggcc gctgcggctg ttcgtgtccg ggcagaccgc cccgcgcgtg 1741cacgagcgcc gcaccgacct gcccggcgac gacggtctgg tggacgagct gcgccggctc 1801ggcaccagcg aggcggcgct ggccgacgag gccctgctcg ccatgtcgct gccggtgctg 1861cgcgccgact accgcgtgct gcgctcctac gcctgggcgg acggaccacc gctgcgggcc 1921ggcatcaccg cgctgtgcgg cgacgccgac ccgctgaccg cgaccgggga cgccgagcgc 1981tggttgcagc actcggtcat ccccggccgg accaggacct tccccggcgg gcacttctac 2041ctgggtgaac aggtcaccga ggtggccggt gccgtgcgcc gggacctgct acgcgccggg 2101cttgcgggct gaggcgatca cgaagtcgag cgcgggcagc tcgcccttca tgcccgagtc 2161gctggtcagc gaccgcttga cctggctgta gaagagcctg ctcacgctct tcttgaacga
2221ctcgtcctgc aggcacctgg ctg
所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该酶切位点。这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。并保证所需扩增的DNA序列中无该酶切位点（generuner分析）。
3.初步确定设计的引物长度。
一般为15～30bp，引物过短会影响到扩增的特异性，过长会影响扩增速率。如果扩增产物≤500bp，引物长度为16～18bp即可。若扩增产物为4～5kb，引物最好不要少于24bp。引物3’末端应含有所研究基因特异序列中的17～30bp。
4.5正向引物的设计：
4.1酶切位点的位置选择。一般情况下都需要在引物的5’，3’端增加酶切位点，然后利用该酶将扩增产物切下，接到相应的载体上。
A：扩增的DNA用于表达时：
（1）自身有启动子。如：
LOCUS VITVHBA689bp DNA linear
BCT26-APR-1993
DEFINITION Vitreoscilla sp.hemoglobin(VHb)gene,partial cds.
山东省社会主义学院ACCESSION M30794M31721X13516
VERSION M30794.1GI:155319
KEYWORDS hemoglobin;promoter region.
SOURCE Vitreoscilla sp.
ORGANISM Vitreoscilla sp.
Bacteria;Proteobacteria;Betaproteobacteria;Neisseriales;
Neisseriaceae;Vitreoscilla.
REFERENCE1(bases42to689)
机械心脏AUTHORS Khosla,C.and Bailey,J.E.
TITLE The Vitreoscilla hemoglobin gene:molecular cloning,nucleotide sequence and genetic expression in Escherichia coli
JOURNAL Mol.Gen.Genet.214(1),158-161(1988)
MEDLINE89143453
PUBMED3067078
REFERENCE2(bases1to210)
AUTHORS Khosla,C.and Bailey,J.E.
TITLE Characterization of the oxygen-dependent promoter of the
Vitreoscilla hemoglobin gene in Escherichia coli
JOURNAL J.Bacteriol.171,5995-6004(1989)
口腔蝇蛆病
COMMENT Original source text:Vitreoscilla sp.DNA.
SWISS-PROT;P04252;BAHG$VITSP.
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..689
/organism="Vitreoscilla sp."
/mol_type="genomic DNA"
/db_xref="taxon:60"
misc_signal33..40
/note="promoter2"
-35_signal55..61
-10_signal73..79
misc_signal86..92
/note="promoter1"
RBS130..133
/note="putative ribosome binding site;putative"
CDS142..582
/note="hemoglobin"
/codon_start=1
/transl_table=11
/protein_id="AAA27585.1"
/db_xref="GI:155320"
/translation="MLDQQTINIIKATVPVLKEHGVTITTTFYKNLFAKHPEVRPLFD MGRQESLEQPKALAMTVLAAAQNIENLPAILPAVKKIAVKHCQAGVAAAHY PIVGQEL
ORIGIN
1aagcttacag gacgctgggg ttaaaagtat ttgagttttg atgtggatta agttttaaga
61ggcaataaag gtgctgctac accatactga tgtatggcaa aaccataata accatactga
121atgaacttaa ggaagaccct catgttagac cagcaaacca ttaacatcat caaagccact
181gttcctgtat tgaaggagca tggcgttacc attaccacga ctttttataa aaacttgttt
241gccaaacacc ctgaagtacg tcctttgttt gatatgggtc gccaagaatc tttggagcag
日本豆乳
拉美债务危机301cctaaggctt tggcgatgac ggtattggcg gcagcgcaaa acattgaaaa tttgccagct
361attttgcctg cggtcaaaaa aattgcagtc aaacattgtc aagcaggcgt ggcagcagcg
421cattatccga ttgtcggtca agaattgttg ggtgcgatta aagaagtatt gggcgatgcc
481gcaaccgatg acattttgga cgcgtggggc aaggcttatg gcgtgattgc agatgtgttt
541attcaagtgg aagcagattt gtacgctcaa gcggttgaat aaagtttcag gccgctttca
601ggacataaaa aacgcaccat aaggtggtct ttttacgtct gatatttaca cagcagtttg
661gctgttgcca aaacttggga caaatattg
①扩增片段里应包含启动子，所以酶切位点应该在启动子前面。
②可在所扩增的DNA序列的启动子前寻是否有该酶切位点，若有则直接利用该酶切位点进行扩增；若无可寻与其基本相似的位点进行扩增。
（2）扩增片段里自身无启动子。
因为在5’端增加的酶切位点（所选的酶切位点与启动子的酶切位点相同）中必须含起始密码子，如NcoI（CCATGG），Nde I(CATATG)，设计引物时，酶切位点的起始密码子要和DNA序列的起始密码子重叠。如上例：若添加的酶切位点为NdeI，引物的5’端酶切位点应设计位5’—CATATGTTAGAC—3’；若添加的酶切位点为NcoI，因为其位点ATG后的G与DNA起始密码子后的T不配对，在处理这个问题上有两种方法：一种是用G取代T，其缺点是破坏了阅读框，可能对表达会有影响；另外一种方法是将酶切位点上的G改为T，相应的酶切位点应改为ACATGT，并查询是否有该酶存在，若有，可以直接利用，因为同尾酶
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