机制中的作用及应用进展美国证人保护计划
svi崔孟颖 冯其贞 武 菲△
（神经生物学研究所，济宁医学院，济宁２７２０６７） 摘要 蛋白激酶ＣＫ２（ｃａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅ２，ＣＫ２）是一种高度保守的丝／苏氨酸蛋白激酶，广泛分布于真核细胞的胞质和胞核中。ＣＫ２可通过对其底物的磷酸化作用调制底物的生物学活性，从而参与细胞内多条重要的信号转导通路。越来越多的研究发现，在多种神经退行性疾病中ＣＫ２表达及活性异常，是其病理生理机制的重要一环，提示ＣＫ２有重要的研究意义，可能是某些神经退行性疾病潜在的靶点。本文将对ＣＫ２在多种神经退行性疾病中病理生理作用以及ＣＫ２抑制剂、激动剂的最新研究进展作一综述。 关键词 ＣＫ２；神经退行性疾病；ＣＫ２抑制剂
时珍国医国药中图分类号 Ｒ３３８
ＲｏｌｅａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＰｒｏｇｒｅｓｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅＣＫ２ｉ
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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ＣＫ２；Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅ；ＣＫ２ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
酪蛋白激酶（ｃａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＣＫ）是一种高度保守的非环核苷酸依赖的丝／苏氨酸蛋白激酶，包括ＣＫ１、ＣＫ２和Ｇｏｌｇｉ ＣＫ（Ｇ ＣＫ）／Ｆａｍ２０Ｃ（ｆａｍｉｌｙｗｉｔｈｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ２０，ｍｅｍｂｅｒＣ）。最初在体外实验中发现，肝脏及其他组织中获取的ＣＫ可磷酸化酪蛋白，因此ＣＫ得以命名为酪蛋白激酶。后来证实，Ｇ ＣＫ可参与分泌期乳腺细胞高尔基体中酪蛋白片段的磷酸化，但是酪蛋白并非ＣＫ１、ＣＫ２的天然底物，为避免混淆，目前仅沿用其英文简称，而不再称其为酪蛋白激酶［１］。ＣＫ２是真核细胞中重要的多效性激酶之一，广泛分布于真核细胞的胞质和胞核中，参与大量磷酸化蛋白质的生成［２］。ＣＫ２在哺乳动物的神经系统中高度表达、广泛分布，ＣＫ２及其底物在神经元或神经胶质的稳态以及突触信号传导中发挥着重要作用。大量证据表明，ＣＫ２是阿尔茨海默病、帕金森病等病理生理机制中的重要调节因素之一。
国家自然科学基金（８１８７０９４８）；山东省自然科学基金（ＺＲ２０１９ＰＣ００７）；山东省医药卫生科技发展计划项目（２０１６ＷＳ０１６２）；济宁医学院青年教师科研扶持基金（ＪＹ ＦＣ２０１８ＫＪ０２２）；济宁医学院大学生创新训练计划项目（ｃｘ２０１８０３１）资助课题
△通讯作者 ｗｕｆｅｉ＠ｍａｉｌ．ｊｎｍｃ．ｅｄｕ．ｃｎ
一、ＣＫ２的基本结构
ＣＫ２全酶是由两个催化亚基（α／α＇）和两个调节亚基（β）组成的异源四聚体，可结合为α
２
β２、αα＇β２或者α＇２β２的形式。ＣＫ２α、α＇、β亚基分别由ＣＳＮＫ２Ａ１、ＣＳＮＫ２Ａ２及ＣＳＮＫ２Ｂ三个基因编码，两个催化亚基α和α＇在结构上高度同源，Ｎ端的３３０个氨基酸序列具有９０％的相似性，β亚基与其他已知的蛋白质则无明显同源性。
ＣＫ２的两个催化亚基并没有直接接触，而是由２个调节亚基首先形成稳定的同源二聚体，形成“桥梁”结构，其延伸的Ｃ端尾再连结两个催化亚基，从而形成全酶结构。催化亚基可磷酸化特异性底物，而调节亚基则维持全酶结构稳定性，并调制催化亚基与底物结合的特异性。但是ＣＫ２并非必须结合为全酶才能发挥作用，ＣＫ２α和ＣＫ２α＇亚基可以在细胞中独立存在并具有催化活性［３］。与大
多数蛋白激酶不同，ＣＫ２全酶或游离的催化亚基为组成型激活，即使没有特定的刺激也具有催化活性。这种高度保守的结构和组成型活性充分保证了ＣＫ２调控底物的高效性和精确性。
二、ＣＫ２在神经系统中的表达及分布
ＣＫ２活性检测结果显示，ＣＫ２在成年大鼠的所有脑区均有较高活性，大脑半球中ＣＫ２活性略高于间脑、小脑和脑干，在皮层锥体神经元及大纹状体神经元中表达量高于其他神经元。对亚细胞组分进行分析，发现与核糖体相关的蛋白质组分中ＣＫ２活性较高，远高于细胞质可溶性组分。在大鼠尾壳核中，４５％ＣＫ２活性来自胞质，２０％来自突触小体。研究发现，ＣＫ２的一些底物特异性地存在于神经系统中，如ＤＡＲＰＰ ３２（ｄｏｐａｍｉｎｅａｎｄｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰｒｅｇｕ ｌａｔｅｄ３２ＫＤａｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）［３］，提示ＣＫ２及其底物在神经系统中发挥一定的作用。
在成年大鼠的不同脑区中，ＣＫ２各亚基的表达在转录水平及蛋白水平均存在差异。在转录水平，ＣＫ２αｍＲＮＡ总量最高，ＣＫ２βｍＲＮＡ表达量与ＣＫ２α和ＣＫ２α＇表达量并不平衡，更接近于ＣＫ２α＇的表达量。在蛋白水平上，ＣＫ２α表达水平高于ＣＫ２α＇。在小鼠纹状体中，ＣＫ２α ＣＫ２α＇为８ １，在嗅球中ＣＫ２α ＣＫ２α＇的比值升高到２４ １。海马中ＣＫ２α＇蛋白水平较高，ＣＫ２α ＣＫ２α＇为４ １，ＣＫ２α仍占据优势［３］。免疫组化结果显示，ＣＫ２α和ＣＫ２β
比较文学与世界文学在嗅球和小脑等组织中共定位，而ＣＫ２α＇往往检测不到。在小脑中，ＣＫ２α和ＣＫ２β在成熟的ＧＡＢＡ能神经元中呈均匀分布，但ＣＫ２α＇呈散在表达。可推测，ＣＫ２α是主要的催化亚基，并有部分ＣＫ２α游离存在并发挥作用。虽然没有发现ＣＫ２α＇占主导的脑区，但这并不意味着ＣＫ２α＇在神经系统中没有重要功能。在小脑的浦肯野细胞中ＣＫ２α＇的簇状聚集形式可能具有重要的生理功能［３］。
三、ＣＫ２在神经退行性疾病中的病理生理作用
（一）阿尔茨海默病 阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）是一种最常见的年龄依赖性神经退行性疾病，其病理生理特征是细胞外不溶性β 淀粉样蛋白（ａｍｙｌｏｉｄβ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ａβ）沉积形成老年斑（ｓｅｎｉｌｅｐｌａｑｕｅｓ，ＳＰ）、细胞内由过度磷酸化的Ｔａｕ蛋白形成神经原纤维缠结（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙｔａｎｇｌｅ，ＮＦＴ）［４］。采用无标记定量质谱法研究ＡＤ模型小鼠突触体的磷酸化蛋白质组，检测到Ｔａｕ是突触中磷酸化水平最高的蛋白质之一。针对上调的磷酸化位点筛选出２种激酶基序，类似于周期素依赖性蛋白激酶５（ｃｙｃ ｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ５，ＣＤＫ５）和ＣＫ２［５］。ＡＤ时ＣＫ２过度活化，在人脑标本和神经母细胞瘤中证实Ｔａｕ是ＣＫ２的底物，即ＣＫ２过度磷酸化Ｔａｕ蛋白，导致Ｔａｕ蛋白毒性聚集，形成ＮＦＴ；ＣＫ２也可间接地通过其底物诱导Ｔａｕ磷酸化［６］。有体外实验发现，ＣＫ２可以磷酸化载脂蛋白Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ，ａ
ｐｏＥ）的脯氨酸及＋１位点的酸性氨基酸残基，两者的互作导致ＣＫ２活性增强，从而增加Ｔａｕ的磷酸化［３］。
Ａβ可以增强ＣＫ２的活性，从而增强Ｎ 甲基 Ｄ 天冬氨酸（Ｎ ｍｅｔｈｙｌ Ｄ ａｓｐａｒｔｉｃａｃｉｄ，ＮＭＤＡ）通道开放和Ｔａｕ磷酸化，ＮＭＤＡ受体过度活化诱导Ｃａ２＋内流增加，从而异常激活Ｃａ２＋ 依赖性钙调素（Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＣａＭＫ）、ＣＤＫ５、动力蛋白相关蛋白１（ｄｙｎａｍｉｎ ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ１，Ｄｒｐ１）和细胞内氧化还原反应，最终导致线粒体、突触功能障碍、长时程增强（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ＬＴＰ）异常和行为学异常等［３］。ＣＫ２被Ａβ激活，还可抑制快速轴突运输（ｆａｓｔａｘｏｎａｌｔｒａｎｓｐｏｒｔ，ＦＡＴ）。驱动蛋白 １（ｋｉｎｅｓｉｎ １）参与ＦＡＴ，ＣＫ２磷酸化其轻链，致使驱动蛋白与所运载物相分离，从而阻止运输。但是离体实验发现，哺乳动物细胞中ＣＫ２可上调活跃的驱动蛋白。ＣＫ２既可增加驱动蛋白数量，又可促进驱动蛋白与运载物解离，这两种相互作用保持平衡。
总之，ＣＫ２在ＡＤ的若干病理生理机制中起着重要作用，这些机制涉及Ｔａｕ磷酸化、淀粉样前体蛋白（ａｍｙｌｏｉｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＰＰ）加工和Ａβ信号传递等，这表明ＣＫ２有望成为ＡＤ的靶点［７］。目前的基础研究发现，ＣＫ２抑制剂通过改善ＣＫ２过
度活跃造成的底物过度磷酸化，如Ｔａｕ、ＡＰＰ等，减少ＡＰＰ形成可溶性的ｓＡＰＰα，对抗Ｔａｕ过度磷酸化形成ＮＦＴ，改善ＡＤ模型的行为学表现［４］。
（二）帕金森病 帕金森病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ＇ｓｄｉｓ ｅａｓｅ，ＰＤ）是继阿尔茨海默病后第二大常见的神经退行性疾病，其主要细胞病理学标志是黑质多巴胺能神经元变性丢失，在残存神经元内由聚集的α 突触核蛋白（α ｓｙｎｃｌｅｉｎ，α Ｓｙｎ）原纤维形成Ｌｅｗｙ体［８］。Ｌｅｗｙ体内的α Ｓｙｎ在靠近Ｃ端的Ｓｅｒ １２９位点被广泛磷酸化，也是ＰＤ的细胞病理学标志之一。已有的报道显示ＰＤ患者存在铁代谢异常和黑质铁沉积，过量铁与α ｓｙｎ积聚密切相关，铁超载还诱发氧化应激损伤。线粒体功能障碍及氧化应激损伤也是ＰＤ的发病机制之一［９］，α Ｓｙｎ不仅影响突触传递功能，还干扰线粒体的功能。
ＣＫ２和ｐｏｌｏ样激酶（ｐｏｌｏ ｌｉｋｅｋｉｎａｓｅ４，ＰＬＫ）可磷酸化α Ｓｙｎ的Ｓ１２９位点。而铁超载可诱导ＰＬＫ２、ＣＫ２上调，因此α ｓｙｎＳ１２９位点磷酸化水平升高［１０］。大量证据显示ＣＫ２通过磷酸化α ｓｙｎ，参与ＰＤ的氧化应激损伤。抗氧化剂可完全阻断铁超载诱发的ＣＫ２、ＰＬＫ２上调及α ｓｙｎＳ１２９位点磷酸化水平升高［１０］。但有报道ＰＬＫ２、ＰＬＫ３是起磷酸化作用的主要激酶，较ＣＫ２效率更高［１１］。在条件性ＣＫ２基因敲除小鼠（Ｄｒｄ１ Ｃｒｅ或Ｄｒｄ２ Ｃｒｅ）的纹状体组织中发现，尽管ＣＫ２α下调了５０％，但α ＳｙｎＳ１２９位点的磷酸化水平无明显变化［３］。尽管ＣＫ２是否为磷酸化Ｓ１２９位点最主要
的蛋白激酶尚存争议，但是ＣＫ２抑制剂能明显抑制高铁引起的α ｓｙｎ积聚［１０］，抑制ＣＫ２还可减少活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）依赖的α ｓｙｎ积聚［９］。
目前左旋多巴是ＰＤ最有效的药物，但是随着的进行，其疗效降低，左旋多巴诱导的运动障碍（Ｌ ＤＯＰＡ ｉｎｄｕｃｅｄｄｙｓｋｉｎｅｓｉａ，ＬＩＤ）逐渐明显。有报道，黑质神经元ＣＫ２敲除可减轻左旋多巴诱发的ＬＩＤ，其机制可能与ＣＫ２负性调节Ｄ１中棘神经元、胆碱能神经元中的Ｇｏｌｆ 细胞外调节蛋白激酶（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＥＲＫ）信号通路有关［１２］。Ｌｅｅ等（２００４）报道另一种定位于Ｌｅｗｙ体并与α Ｓｙｎ结合的是亲合素，ＣＫ２能在体外磷酸化亲合素，从而改变亲和素与α Ｓｙｎ的相互作用。
（三）亨廷顿病 亨廷顿病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ＇ｓｄｉｓ ｅａｓｅ，ＨＤ）是一种常染体显性遗传的神经退行性疾病，其主要病理表现为纹状体中棘神经元大量缺失。这是由于人类亨廷顿蛋白基因中ＣＡＧ序列大量异常重复，编码产生多聚谷氨酰胺（ＰｌｏｙＱ）的蛋白［１３］，因此导致谷氨酰胺信号的异常以及ＮＭＤＡ受体功能亢进，ＮＭＤＡ受体介导的细胞毒性损伤诱导细胞死亡。Ｆａｎ等（２００８）在体外实验中发现，过表达ＰｏｌｙＱ亨廷顿蛋白的细胞，其ＣＫ２表达也增强。在ＨＤ小鼠模型中也得到证实，ＣＫ２在纹状体而非其他组织中表达上调。取ＨＤ小鼠的纹状体
神经元体外培养，给予ＣＫ２抑制剂可加剧ＮＭＤＡ受体介导的兴奋性毒性损伤，凋亡增多。Ｃｈｕｎｇ等（２００４）证实给予ＨＤ模型小鼠ＣＫ２抑制剂后，ＮＭ ＤＡ受体介导的细胞毒性明显增强，其原因可能是ＮＭＤＡ受体磷酸化诱导的受体内吞。可以推测，ＣＫ２的作用可能是抵抗亨廷顿蛋白诱导的异常谷氨酰胺信号，以及后续的ＮＭＤＡ受体介导的细胞毒性。亨廷顿蛋白的Ｎ１７结构域呈现低磷酸化，是亨廷顿蛋白毒性的调节因素。在存在磷酸基团供体的前提下，ＣＫ２可促进Ｎ１７磷酸化恢复为三磷酸形式。有报道，ＣＫ２与腺嘌呤磷酸核糖转移酶（ａｄｅ ｎｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＰＲＴ）以及氧化性ＤＮＡ损伤的天然产物Ｎ６ 糠胺（Ｎ６ ｆｕｒｆｕｒｙｌａｄｅｎｉｎｅ，Ｎ６ＦＦＡ），在ＤＮＡ损伤的部位共定位，以Ｎ６ＦＦＡ为磷酸基团供体，恢复亨廷顿蛋白Ｎ１７磷酸化，在ＨＤ模型系统中具有保护作用［１４］。
（四）肌萎缩侧索硬化症 肌萎缩侧索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）是一种致死性神经退行性疾病，主要病变部位在锥体束、脑干和脊髓运动神经元，最终因导致死亡［１５］。其病理学标志是神经元和神经胶质细胞中分布的泛素阳性、异常束状蛋白聚集和球状包涵体。ＴＡＲＤＮＡ结合蛋白４３（ＴＡＲＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ４３，ＴＤＰ ４３）主要存在于ＡＬＳ的包涵体中，有研究表明ＴＤＰ ４３的聚集和异常降解是ＡＬＳ的主要致病因素［１６］。Ｈｅｒ ｍａｎ等（２０１４）报道ＴＤＰ ４３在聚集体中发生泛素化和过度磷酸化，而ＣＫ２能在多个位点处驱动其磷酸化，ＣＫ２过度表达增加其磷酸化水
平，从而增加ＴＤＰ ４３的溶解能力，逆转ＴＤＰ ４３的聚集。在表达ＴＤＰ羧基末端片段（ＮＤ２５１和ＮＤ２０７）的细胞和转基因果蝇模型中，过表达ＣＫ２α可促进ＴＤＰ磷酸化，降低包涵体的形成，ＣＫ２抑制剂可阻断这一效应。将丝氨酸突变为丙氨酸，消除ＣＫ２的磷酸化作用，ＴＤＰ的聚集倾向和聚集数增强；而突变为天冬氨酸或谷氨酸，模拟高磷酸化作用则相反。Ｌｉ等（２０１１）发现细胞中包涵体形成在先，而高磷酸化和泛素化发生在后，高磷酸化可能是一种代偿性防御
机制，以对抗致病性ＴＤＰ聚集。
泛素 蛋白酶体系统（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓｙｓ ｔｅｍ，ＵＰＳ）功能异常，残存运动神经元中存在泛素阳性包涵体，是ＡＬＳ的另一病理特征。细胞周期素Ｆ（ＣｙｃｌｉｎＦ）是Ｓｋｐ１ Ｃｕｌ Ｆ ｂｏｘ（ＳＣＦ）泛素连接酶Ｅ３复合物的一部分，负责泛素化蛋白被蛋白酶体降解。ＣＫ２可以磷酸化ＣｙｃｌｉｎＦ的Ｓｅｒ６２１位点，从而调节ＳＣＦ复合物的Ｅ３连接酶活性。在患有家族性和散发性肌萎缩侧索硬化和额颞叶痴呆（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌｄｅｍｅｎｔｉａ，ＦＴＤ）的患者中发现了编码ＣｙｃｌｉｎＦ蛋白的相关基因突变，Ｓ６２１Ｇ突变可阻止ＣＫ２的磷酸化作用，并使Ｌｙｓ４８泛素化活性升高，Ｅ３连接酶复合物活性异常，最终导致运动神经元发育缺陷、神经元变性。上述结果提示ＣＫ２磷酸化作用的重要性，参与ＡＬＳ和ＦＴＤ的发病机制［１７］。因此，通过ＣＫ２增强磷酸化可能是对抗ＡＬＳ的有效策略之一［１７］。
木结构工程施工质量验收规范
（五）Ⅲ型脊髓小脑共济失调 脊髓小脑共济失调（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒＡｔａｘｉａ，ＳＣＡ）是一类常染体显性遗传的神经退行性疾病，患者的脑干、小脑和脊髓由于病变而产生退行性变性萎缩。ＳＣＡ也是一种ｐｏｌｙＱ疾病，其ＭＪＤ１（Ｍａｃｈａｄｏ Ｊｏｓｅｐｈｄｉｓｅａｓｅ，ＭＪＤ）基因产物脊髓小脑型共济失调蛋白（Ａｔａｘｉｎ ３）邻近Ｃ末端出现异常扩增的多聚谷氨酰胺。ＳＣＡ３发病的确切机制尚不清楚，Ｔａｏ等（２００８）提出磷酸化在其发病机制中起着重要作用，而Ａｔａｘｉｎ ３是ＣＫ２的底物。Ｍｕｅｌｌｅｒ等（２００９）发现，在Ａｔａｘｉｎ ３泛素互作基序中的丝氨酸３４０和３５２位点，对正常和扩展的Ａｔａｘｉｎ ３的核定位尤为重要，这些位点的突变大大降低了Ａｔａｘｉｎ ３核内包涵体的形成。ＣＫ２通过调制上述位点的磷酸化，从而影响多聚谷氨酰胺的稳定性以及包涵体在核内定位及聚集。在热应力作用下ＣＫ２介导Ａｔａｘｉｎ ３向核内移位。ＣＫ２抑制剂可降低核内Ａｔａｘｉｎ ３蛋白水平以及核内包涵体的形成。上述结果提示ＣＫ２介导的磷酸化诱导Ａｔａｘｉｎ ３的核内积聚，ＣＫ２的磷酸化作用参与ＰｏｌｙＱ相关疾病的病理生理机制。
四、ＣＫ２抑制剂和激动剂
（一）ＣＫ２抑制剂 自Ｂｕｒｎｅｔｔ等（１９５４）首次报道ＣＫ２以来，关于其结构、功能的研究逐步累积，均为ＣＫ２的开发利用创造了条件。目前已开发出多种ＣＫ２抑制剂，多数属于ＡＴＰ竞争性抑制剂，另有几种非ＡＴＰ竞争性抑制剂，大多数在基础研究中显示出较好的特异性和效率，
但尚无确切的可应用于临床的抑制剂。到目前为止，仅有ＣＸ ４９４５已进入二期临床试验［１８］。目前已开发出的ＣＫ２抑制剂作为工具药，在研究ＣＫ２的过程中发挥了巨大的作用。
１．多卤代苯并咪唑和苯并三唑衍生物：此类化合物属于ＣＫ２的ＡＴＰ竞争性抑制剂，此类型的代表之一为５，６ 二氯 １ （β Ｄ 核糖呋喃基） 苯并咪唑（５，６ ｄｉｃｈｌｏｒｏ １ （ｂ Ｄ ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ） ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ＤＲＢ），为第一例ＣＫ２抑制剂。以卤化核苷ＤＲＢ为基础，又开发出多种苯并咪唑类化合物，特别是多卤代苯并咪唑类，苯环中的溴取代基团显著提高了此类化合物的有效性和选择性，比如４，５，６，７ 四溴苯并三唑（４，５，６，７ ｔｅｔｒａｂｒｏｍｏｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ，ＴＢＢ）。结构 活性关系（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｃｔｉｖｉｔｙｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ，ＳＡＲ）研究表明，只有苯并咪唑的苯环被四卤代时，对ＣＫ２的抑制才显著提高。在ＴＢＢ的基础上，以带极性取代基团的碳原子取代Ｎ２，即ＴＢＩ，后者对ＣＫ２的抑制效应明显提高。Ａｎｄｒｚｅｊｅｗｓｋａ等（２００３）报道，ＴＢＩ衍生物的抑制活性取决于烷基取代基的长度，此类中抑制作用最强的是４，５，６，７ 四溴 ２ （二甲氨基）苯并咪唑（ＤＭＡＴ）。目前，ＴＢＢ和ＤＭＡＴ是基础研究中应用较多的ＣＫ２抑制剂之一，一般仅作为工具药，广泛应用于离体细胞实验和在体动物实验。
２．蒽醌类、黄酮类和香豆素类衍生物：蒽醌类、黄酮类和香豆素类衍生物属于天然化合物，对ＣＫ２也有一定的抑制作用［１９］。大黄素（１，３，８ 三羟基 ６ 甲基 蒽醌）为棕榈大黄的蒽醌衍生
物，具有抗炎、抗肿瘤作用。以大黄素为基础，进一步优化其结构开发出新的蒽醌类，包括ＭＮＡ（１，８ 二羟基 ４ 硝基蒽醌和黄嘌呤衍生物）、ＭＮＸ（１，８ 二羟基 ４ 硝基 黄嘌呤 ９ 酮）等。此类化合物可以穿入ＣＫ２α的活性部位，部分重叠ＡＴＰ结合位点，从而抑制ＣＫ２活性［２０］。目前认为醌茜素（ｑｕｉｎａｌｉｚａｒｉｎ）是蒽醌衍生物中对ＣＫ２抑制作用最强且特异性最高的［２１］，其作用在白血病细胞等细胞系中得到验证，是常用的ＣＫ２抑制工具药之一。
黄酮类的代表性化合物为槲皮素和芹菜素，但黄酮类化合物的特异性差，对包括ＣＫ２在内的多种蛋白激酶均有抑制作用，黄酮类化合物的应用也因此受到限制。香豆素衍生物是天然的苯并吡喃酮衍生物，一般认为是其代谢物具有ＣＫ２抑制作用，此类物质如３，８ 二溴 ７ 羟基 ４ 甲基铬 ２ 酮（ＤＢＣ）的ＣＫ２抑制作用在离体实验中已得到证实，但选择性较差。
３．羧酸衍生物：此类抑制剂的骨架互不相同，但
共同结构为羧基，可与ＣＫ２ＡＴＰ结合位点的Ｌｙｓ６８发生互作，从而发挥作用。此类型又可进一步分为三种，多卤化苯基羧酸（如ＴＢＣＡ）、锑酸衍生物和三环喹啉类似物（如ＣＸ４９４５（５ （３ Ｃｈｌｏｒｏ ｐｈｅｎｙｌａｍｉ ｎｏ） ｂｅｎｚｏ［ｃ］ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｅ ８ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ））。
（Ｅ） ３ （２，３，４，５ 四溴苯基）丙烯酸（（Ｅ） ３ （２，３，４，５ ｔｅｔｒａｂｒｏｍ
ｏｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌｉｃａｃｉｄ，ＴＢＣＡ），是在一系列三溴和四溴衍生物的基础上，用极性的羧基取代了五原子三唑环，其抑制作用和特异性均较好，这与羧基有关，如果用甲基或酰胺取代羧基，其特异性将急剧下降。ＴＢＣＡ也是ＣＫ２抑制常用的工具药之一。
通过结构设计发现多种ＣＫ２抑制剂与聚ＡＤＰ核糖聚合酶（ｐｏｌｙ ＡＤＰ ｒｉｂｏｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＰＡＲＰ）抑制剂结构相似，根据ＰＡＲＰ抑制剂的结构合成了一系列新的化合物，具有良好ＣＫ２抑制活性，包括ＣＸ ４９４５。ＣＸ ４９４５是第一例口服安全的小分子ＣＫ２抑制剂，在小鼠模型中静注和口服后保持较稳定的生物利用度，是迄今报道的特异性最好的ＣＫ２抑制剂之一［２２］。已在多种细胞系中验证了ＣＸ ４９４５对内源性ＣＫ２的抑制作用，影响细胞的增殖，并致其凋亡。
４．吡唑三嗪、咔唑吡啶、苯并吡啶酚及其吲哚衍生物：以聚环支架为特征的几种衍生物已被证实为最有效的ＣＫ２抑制剂家族之一，可在纳米摩尔级别发挥作用。离体实验证实此类化合物对肿瘤细胞的ＣＫ２活性有明显的抑制作用。吡哆醇和苯并吡啶酚衍生物为ＣＫ２和拓扑异构酶ＩＩ的多靶点抑制剂。相对于其他ＣＫ２抑制剂，此类不是常用的工具药。
５．非ＡＴＰ竞争性抑制剂：以其他蛋白激酶的应用开发为指导，最近也对ＣＫ２进行了非ＡＴＰ竞争性机制的研究和开发，包括干扰α、β亚基的互作、靶向底物的识别位点等。通过检测ＤＲＢ、甘油
与ＣＫ２催化亚基复合物的晶体结构，发现了一个新变构位点，即ＣＫ２α β４／β５位置，重叠了ＣＫ２α和β亚基之间的二聚界面，从而抵消ＣＫ２α／ＣＫ２β复合物的形成，此位点可供药物研发。此外，α β４／β５区域显示了人类ＣＫ２α和α＇之间有趣的差异，也可用于设计能够区分两种催化亚基的特定分子。针对此变构位点的小分子肽、环肽等衍生物能够在体外破坏ＣＫ２全酶结构。另一个研究思路是靶向ＣＫ２的底物识别位点，从而选择性地抑制ＣＫ２的活性。Ｐｅｒｅａ等（２００４）通过筛选随机环肽噬菌体展示文库，鉴定了一种肽类Ｐ１５，靶向ＣＫ２底物酸性磷酸化结构域，从而抑制ＣＫ２对底物的磷酸化。
（二）ＣＫ２激动剂 在早期研究中以酪氨酸、真核细胞转录起始因子的磷酸化水平为检测标准，发现多胺类如精胺、亚精胺为ＣＫ２激动剂。人体网织红细胞中含有较高浓度的精胺和亚精胺，其ＣＫ２活性增加２．５倍，推测至少在此细胞中精胺、亚精胺为ＣＫ２激动剂。多胺通过增加ＣＫ２α和ＣＫ２β的蛋白水平及稳定性，增加总ＣＫ２激酶活性。由于鸟氨酸脱羧酶（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＯＤＣ）是多胺合成中的限速酶，ＯＤＣ过表达可致转基因小鼠模型中ＣＫ２活性增强。ＯＤＣ过表达和多胺水平升高不仅可以提高ＣＫ２活性及其蛋白水平，而且还促进其亚基在胞内重分布。
另一大类ＣＫ２激动剂为含有大量碱性氨基酸的分子，包括含有多个寡精氨酸簇的鱼精蛋白、碱性蛋白分子组蛋白Ｈ２Ｂ
２
、Ｈ２Ｂ
３
忆大唐
、鲑精蛋白等。Ｍａｅｋａ ｗａ等（２００２）报道，含有多精氨酸簇、多赖氨酸簇的天然或合成多肽，通过结合ＣＫ２β亚基上调ＣＫ２活性。Ｋａｔａｎｏ等（２００５）发现，上述碱性氨基酸与β亚基Ｎ端的酸性氨基酸位点５５ ６４结合，诱发ＣＫ２构象改变，从而提高底物与催化亚基α的亲和力。
除了上述调节机制，有报道一些生物肽可以通过胞内Ｇ蛋白信号通路上调ＣＫ２蛋白水平及活性，但具体机制有待进一步研究［２３］。尽管已有的研究显示某些多胺、肽类、细胞内蛋白等可上调ＣＫ２活性或者蛋白水平，但目前尚无广泛认可的工具药作为ＣＫ２激动剂。目前的基础研究多采用构建质粒转染、重组ＣＫ２激酶等方式，作为上调ＣＫ２的工具进行相关实验［２４］。
五、结语和展望
神经退行性疾病等神经系统疾病尚缺乏有效的特异物和，加之血脑屏障对药物具有更高的选择性，因此寻有效的手段仍是一大难题。根据已有的报道，ＣＫ２在多种神经退行性疾病的病
理生理过程中起着重要作用，提示ＣＫ２有望成为靶点，为开发新型药物提供思路［２５］。随着更深入地研究ＣＫ２的神经生物学特性及病理生理作用，特别是ＣＫ２抑制剂在肿瘤中的应用，越来越多的ＣＫ２作用位点被发掘，为神经系统疾病的基础和临床研究提供了理论基础和研究依据。
参考文献
１ ＣｏｚｚａＧ，ＰｉｎｎａＬＡ．Ｃａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅｓａｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
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