广东医学院真菌之怒
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硕士学位论文
淋巴细胞特异性酪氨酸蛋白激酶基因多态性与阿尔茨海默病的 姓名：***
申请学位级别：硕士
专业：神经病学
指导教师：***
20050501
淋巴细胞特异性酪氨酸蛋白激酶基因多态性
与阿尔茨海默病的相关性研究
中文摘要
【目的ｌ
近来研究表明许多趋化因子及其相关受体在阿尔茨海默病脑内表达上调，进一步支持淋巴细胞可能参与了阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓｄｉｓｅａｓｅ．ＡＤ）的发病机制。淋巴细胞特异性酪氨酸蛋白激酶（１ｙｍｐｈｏｃｙｔｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ，ＬＣＫ）是淋巴细胞特有的酪氨酸蛋白激酶Ｓｒｃ家族成员，在Ｔ细胞激活和Ｔ细胞受体ＣＤ４与ＣＤ８的相互作用中具有重要作用。目前已经证实ＬＣＫ基因在ＡＤ患者海马区锥体神经细胞中表达显著下调．而且ＬＣＫ基因位于明确的ＡＤ遗传连锁区（１＃４－３６），因此ＬＣＫ可能是又一新的ＡＤ候选基因。本研究的目的是研究人中ＬＣＫ基因多态性。载脂蛋白Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ，ＡＰＯＥ）基因多态性及与阿尔茨海默病的相关性。 ［方法］
采用病例．对照方法研究ＬＣＫ基因多态性、ＡＰＯＥ基因多态性与ＡＤ的相关性。ＡＤ病例组３８０人，包括３２７例迟发型阿尔茨海默瘸（ＬＯＡＤ）和５３例早发型阿尔茨海默病（ＥＯＡＤ），男女比例为１１２（２９．５％）：２６８（７０．５％）；非痴呆对照组３８０人，男女比例为１７２（４５．３％）：２０８（５４，７％）。使用ＴａｑＭａｎ－ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）法检测ＬＣＫ基因＋６４２４ＭＧ位点单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ），分析３种基因型（Ｇ／Ｇ，ＧｆＡ，Ａ／Ａ）及两等位基因Ｇ与Ａ的分布频率。ＡＰＯＥ基因分型是ＰＣＲ—ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ｛ｉ．ａｇｍｅｍｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法。
［结果］陇西秧歌
在本研究人中ＡＰＯＥＥ４携带者的频率在ＡＤ组是４８．９％（１８６／３ＳＯ），对照组１５．ｇ％（６０／３８０），经卡方检验差别有显著性（Ｘ２－－－－－９５．４，Ｐ－－－－０．０００００，ＲＲ＝５．１ｌ，９５％ＣＩ＝３．６３．７．１９）；ＬＣＫ基因＋６４２４Ａ／Ｇ位点具有多态性，较小等位基因频率为４３％，分析表明纯合子Ｇ／Ｇ基因型与ＡＤ呈显著相关，其中总ＡＤ组与对照组（’盘
－－－－５．４３，Ｐ＝０．０２０，ＲＲ＝１．４１，９５％ＣＩ＝Ｉ．０６—１．８７），ＬＯＡＤ亚组与对照组＆２＝４．２８，Ｐ－－－０．０３９，ＲＲ＝１．３７，９５％ＣＩ＝Ｉ．０２．１．８５）；排除ＡＰＯＥｅ４效应后Ｇ／Ｇ基因型与ＡＤ仍呈显著相关（犯＝７，６５，Ｐ＝０．００６，ＲＲ＝１．６６，９５％Ｃ１＝１．１６—２．３８），与ＬＯＡＤ也呈显著相关（ｘ２＝６．４０，Ｐ＝０．０１１，ＲＲ＝１．６４，９５％ＣＩ＝Ｉ．１２—２．４０），同时风险
等位基因Ｇ频率在对照组中为６６％，明显低于ＡＤ组７２％（妲＝４．５５，Ｐ＝０．０３３）和ＬＯＡＤ亚组７３％（ｚ２＝４．６９，Ｐ＝０．０３０）：Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析显示ＡＰＯＥ基因与ＬＣＫ基因没有相互作用（Ｐ＝０．０７９）。
［结论］
ＬＣＫ基因＋６４２４Ａ／Ｇ多态位点与阿尔茨海默病显著相关，Ｇ等位基因增加了ＡＤ的发病风险，ＡＰＯＥ．ｅ４携带者的频率与ＡＤ高度显著相关，并具“剂量依赖”效应，ＬＣＫ基因是独立于ＡＰＯＥ基因的新风险基因，本研究结果支持ＬＣＫ参与阿尔茨海默病相关的神经炎症与免疫机制，因此很有必要进一步深入研究。
关键词：阿尔茨海默病，淋巴细胞特异性酪氨酸蛋白激酶，载脂蛋白Ｅ，单核苷酸多态性，遗传风险因子，炎症
１前言
１．１研究背景
阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’Ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）是在中老年人中出现痴呆和智能损害的最常见原因，其主要表现为进行性全面性记忆力下降和多种认识功能受损【１．２１。目前的临
床诊断主要依靠神经系统体查．神经心理学和脑影像学检查。尸检发现老年斑（ｓｅｎｉｌｅｐｌａｑｕｅ）和神经纤维缠结（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙｔａｎｇｌｅ）是确诊并排除其他类型痴呆的两大病理标志物【３．４】。而这两大病理表现主要发生在颞叶新皮质和海马区。分子生物学的研究表明细胞外的Ｂ淀粉样多肽（１３．ａｍｙｌｏｉｄ，Ａ∞沉积和细胞内的微管相关蛋白．Ｔａｕ蛋白的过度磷酸化是出现上述病理改变的主要生物学基础，其中Ｔａｕ蛋白磷酸化在神经元内形成成对螺旋细丝，即在光学显微镜下观察到的神经纤维缠结；Ｂ淀粉样多肽（Ａｐ）是由一个Ｂ淀粉样前体蛋白（ｐ－ａｍｙｌｏｉｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＰＰ）经过Ｂ—ｓｅｃｒｅｔａｓｅ和Ｙ—ｓｅｅｒｅｔａｓｅ裂解而来的４０至４２个氨基酸的多肽【５．６】。分予遗传学研究表明以下四个基因参与了ＡＤ的发病：它们分别是位于第２ｌ号染体上的ＡＰＰ基因（Ａｍｙｌｏｉｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＩＭ＃１０４７６０）、第１４号染体上的早老素ｌ（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎＩ，ＭＩＭ＃６００７５９）基因和第ｌ号染体上的早老素２（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ２，ＭＩＭ＃１０４３１１）基因及第１９号染体上的ＡＰＯＥ基因（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ－Ｅ，ＭＩＭ＃１０７４１１）【７－９】。其中ＡＰＰ，ＰＳＥＮＩ和ＰＳＥＮ２基因的突变是家族性早发性ＡＤ的主要病因，而流行病学调查表明其在ＡＤ病例中所占比例不到５％，并按盂德尔规律遗传。其余９５％的病例为散发性迟发型ＡＤ，即ＬＯＡＤ（１ａｔｅ．ｏｎｓｅｔＡｌｚｈｅｉｍｅｒｄｉｓｅａｓｅ），近年来关于ＬＯＡＤ研究表明其具有由环境和遗传因素相互作用的复杂病因，迄今为止仅有ＡＰＯＥ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ）￡４等位
基因被认为与ＬＯＡＤ相关ｔ１０．１ＩＩ。而且在遗传变异引起ＬＯＡＤ中。ＡＰＯＥ基因至多只占５０％，另外４２．６８％的ＬＯＡＤ病例没有ＡＰＯＥ６４等位基因．从而提示还有其他易感基因也会以不同的多态性影响着ＡＤ的发病风险［１０，１２．１３１。研究显示这些基因大多相关于蛋白水解酶，血浆蛋白，生长因子或膜受体及炎症相关因子，并以不同的遗传变异存在，参与了ＡＰＰ的处理或Ａｐ的产生，降解或清除［１４，２１１。
近年来分子生物学技术的进展表明单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ＳＮＰｓ）是研究疾病遗传基础的有力手段。其不仅可以用于位置性克隆研究，也可以用于宽泛的遗传相关性研究ｆ２２】。这些多态性本身就可能代表了影响疾病易感性或进展的遗传变异，因而通过对疾病相关基因变异的评价是明确致病基因的重要环节。
越来越多的证据表明炎症介导和免疫系统在ＡＤ的脑变性过程中具有重要作用【２３】。许多趋化因子及其相关受体在ＡＤ脑中表达上调，进一步支持淋巴细胞参与了ＡＤ发病机制的假说［２４－２７】。淋巴细胞特异性酪氨酸蛋白激酶（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ，ＬＣＫ）是淋巴细胞特有的酪氨酸蛋白激酶Ｓｒｃ家族成员。在Ｔ细胞激活和与Ｔ细胞受体ＣＤ４和ＣＤ８的相互作用中具有重要作用［２８—３０１。ＯｍｒｉＢ等使用原位杂交和免疫组化技术研究表明ＬＣＫ基因可以在脑组织的不同区域表达，包括海马区和小脑。
尤其在锥体细胞树突中表达最高［３１·３２］。Ｒｙｕｊｉ等通过ｅＤＮＡ微序列技术（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｌＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）分析发现ＬＣＫ在病理确诊的ＡＤ患者海马区锥体神经细胞中表达显著下调【３３】。进一步来说，人类ＬＣＫ基因位于以前明确与ＡＤ相关的遗传连锁区（１ｐ３４．３６，Ｅｎｓｅｍｂｌ１５．３３．１：ｓｅｑｕｅｎｃｅＡＬｌ２１９９１．５０．１．６１５１５），具有１２个外显子，分布在长１４ｋｂ的基因组ＤＮＡ上［３４—３５】。它的表达由两个起动子驱动。远端和近端启动子。在不同发育时期激活，相隔至少有３５ｋｂ的距离［３６１。目前对ＬＣＫ多态性在Ｔ细胞白血病，结肠癌，１型糖尿病，系统性红斑狼疮，复发一缓解型多发性硬化和类风湿性关节炎中的潜在作用已有报道１３６，３７－４３］。所有这些资料表明ＬＣＫ可能是影响ＡＤ发病机制的候选基困，因而有必要对ＬＣＫ基因多态往与ＡＤ的相关性进行研究。
１．２研究目的
astm标准
本研究的目的是通过调查日本人中ＬＣＫ基因多态性，ＡｐｏＥ基因多态性的分布情况，并分析其在阿尔茨海默病发病中的相互作用。及其在ＡＤ发病中的风险因子角。山西科教频道小郭跑腿
１。３研究内容世博文化中心
（１）按病例．对照的研究方法在中日本关西地区收集３８０例ＡＤ患者和３８０例非
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