石镜明;贺学;廉会娟;吴涛;武美娜;孙正启
【摘 要】使用交联剂双琥珀酰亚胺辛二酸酯磺酸钠盐(Bis (sulfosuccinimidyl),BS3)对Aβ1-42进行交联,通过与之前报道的戊二醛交联进行比较分析,可以看出BS3更适合分析蛋白的寡聚状态,这将为Aβ蛋白及类似的易聚集蛋白在体内、外研究提供很好的参考.%An agent named bis(sulfosuccinimidyl) (BS3) is used to cross-link Aβ1-42.Compared with glutaraldehyde which was previously reported as an Aβ cross-linking agent,it is not difficult to find that BS3 is more suitable for the analysis of protein in extra-membrane Aβ oligomers states,which will provide a good experimental method to analyze Aβ protein and similar easy aggregation protein in vivo and vitro studies.
西村工人体育场【期刊名称】《西北大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2017(047)002
【总页数】5页(P222-226)
【关键词】双琥珀酰亚胺辛二酸酯磺酸钠盐(BS3);β淀粉样蛋白;寡聚体 【作 者】石镜明;贺学;廉会娟;吴涛;武美娜;孙正启
【作者单位】西藏民族大学医学院/高原环境与疾病相关基因研究实验室,陕西咸阳712082;西藏民族大学医学院/高原环境与疾病相关基因研究实验室,陕西咸阳712082;西藏民族大学医学院/高原环境与疾病相关基因研究实验室,陕西咸阳712082;西藏民族大学医学院/高原环境与疾病相关基因研究实验室,陕西咸阳712082;西藏民族大学医学院/高原环境与疾病相关基因研究实验室,陕西咸阳712082;西藏民族大学医学院/高原环境与疾病相关基因研究实验室,陕西咸阳712082
【正文语种】中 文
【中图分类】Q518.4
AD是老年性痴呆症中常见的型式,目前全世界大约2420万AD患者,预计每20年将翻一番,中国照料痴呆的直接花费大约为每年28亿美元[1-2]。人们普遍认为Aβ是AD的致病主因[3]。AD脑脊液中的Aβ、总tau蛋白含量及磷酸化的tau蛋白(即Aβ1-42,T-tau蛋白和p-tau蛋白)含
量,被用作生物标识物(Biomarkers)加以检测,这些指标已经成为防治AD不可缺少的一部分[4-5]。
Aβ1-42是β淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)经过β和γ分泌酶水解产生的,产生后讯速形成可溶性的寡聚体,这些寡聚体在AD病理起始阶段中发挥着关键的毒性作用[6-7]。Aβ1-42寡聚体并不是单一的几聚体,而是由很多种寡聚组成,例如,3聚体,4聚体,56聚体,高聚的原纤维(Protofibrils)等[6-8],即便是电镜上观察非常均一的ADDL(Aβ-derived diffusible ligands)也是由从2聚体至24聚体不等的几十种混合物组成的,很难确定究竟是几聚体在发挥毒性作用。在毒性机制基础研究中,电泳分析是经常用到的检测方式之一。
Aβ1-42很容易受到变性剂SDS破坏,还会受到丙烯酰胺胶孔道的挤压,Aβ单体和寡聚体条带常常仅以单体、3聚和4聚3种形式出现,而不能显示出其本身的聚集形式。这需要使用天然胶或者交联剂,不被SDS等去垢剂破坏,研究者使用戊二醛交联或光交联[9-11]来达到分析目的。BS3作为一种易溶于水的化合物在蛋白及抗体的交联过程中曾有过报道[12-13],本文将详细报道BS3对于Aβ1-42/40的交联，区分蛋白的单体和各种寡聚体形式，为AD病理机制的分析提供很好的帮助。
1.1 材 料
表达的Aβ1- 42肽购自rpeptide公司(Athens, GA,美国),交联剂BS3购自Sigma.鼠源单克隆抗体DE2,ECL显剂均购自Millipore (Millipore, MA),1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) 、二甲基亚砜DMSO均购自Sigma,F-12 培养基 (Ham′s F-12, BioSource, 澳大利亚),透射电子显微镜型号Tecnai G20 (FEI)。
1.2 方 法
1.2.1 Aβ1-42单体化处理 1mg Aβ瓶中加入222ul HFIP,在旋涡振荡5min,4℃慢摇过夜,按8.6μL/管分装,N2流吹干,-80℃下冻存备用[14]。
1.2.2 ADDL寡聚体和原纤维寡聚体的制备 ADDL的制备条件,Aβ1-42加入F12培养基中使得终浓度为100μmol/L,在4℃孵育24h[15]。原纤维的制备条件,Aβ1-42加入到Tris缓冲液(50mmol/L Tris,100mmol/L NaCl,PH=7.4)浓度为200μmol/L,室温下慢摇孵育24h[16]。
1.2.3 交联及电泳条件 将Aβ1-42加入PBS缓冲液中,加入0.3mmol/L BS3,冰浴交联2min,加入1mol/L Tris,PH7.4的终止液终止,电泳时加入5×上样缓冲液,90℃煮5min上样。戊二醛交
联,使用0.3mmol/L或其他浓度的戊二醛,交联1min,加入1mol/L Tris,PH 7.4的终止液终止,加入5×上样缓冲液,90℃煮5min上样。银染分析选用4%浓缩胶和16.5% Tris-Tricine分离胶,所有的West Blot实验中,采用4%～16.5%的梯度胶进行。
水凝萃1.2.4 电镜样品制备 用Aβ42溶液2μL加到放电/亲水化处理的碳膜上,孵育1 min后,用超纯水清洗,然后用1%(质量分数)磷钨酸钠负染1min。吸去多余液体,将筛格在空气中干燥备用。
辛二酸二琥珀酰亚胺(Disuccinimidyl suberate,DSS)是一种不溶于水的N-羟基的琥珀酰亚胺酯(NHS-ester),如图1A所示。双琥珀酰亚胺辛二酸酯磺酸钠盐(Bis(sulfosuccinimidyl),BS3)是DSS水溶性的形式,当BS3 溶解后,就会讯速脱去含N 部分,从而在分子的两头与蛋白N-端的α-氨基酸或者赖氨酸发生反应,Aβ1-42具有Lysine-18和Lysine-28两个赖氨基酸与BS3产生交联,反应可以通过1mol/L Tris，HCl或者1mol/L Glycine溶液来终止。本文采用易溶于水的BS3交联Aβ1-42蛋白,并使用1mol/L Tris，HCl来终止交联反应。
姚刚与李继红2.1 BS3对Aβ单体的交联控制
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先前的Aβ交联报道中,对Aβ1-40与膜作用进行了说明[10-11,16]。本文采用0.3mmol/L,0.6m
mol/L,1.2mmol/L 3个浓度梯度,并采用不同的交联时间,在冰浴条件下对Aβ42/40单体进行交联比较,并通过同样浓度的BS3对Aβ1-42/40单体进行交联,通过对交联剂浓度、交联时间的控制,结果如图2所示,可以看出,戊二醛即使在最低浓度(0.3mmol/L)下,采用很短的交联时间(1min),不管是Aβ1-40还是Aβ1-42均会被交联成寡聚体;而使用BS3交联1min,两种蛋白单体不会导致寡聚体形成,时间延长至5min,单体也会发生寡聚变化。这说明使用BS3作为交联剂只要控制交联时间在5min以内就不会导致单体的交联发生。从图2还可以看出1.2mmol/L浓度交联更弱。
2.2 BS3较戊二醛更适用于Aβ的交联
ADDL与原纤维是最常见的两种Aβ1-42聚集形式[16],通过16.5%(质量分数)的Tris-tricine胶分析Aβ1-42的单体、ADDL及原纤维3种形式。在不交联的情况下,没有明显的差别(图3不交联的两图)。使用0.3mmol/L戊二醛交联Aβ1-42单体、ADDL及原纤维3种形式,即使只有30s也很容易出现整体过度交联,从而导致Aβ1-42的3种形式并没有差异(图3 0.3mmol/L戊二醛交联所示)。使用0.3mmol/L蛋白浓度的BS3交联10min,3种蛋白条带之间存在较大差别,单体交联后,出现少量3聚和4聚形式,ADDL除3聚和4聚外还出现其他5聚体和更高的寡聚形
式,原纤维经过交联后,4聚和3聚减少,但是明显有其他形式的聚集体存在,还可能存在高聚未进入分离胶内,结果如图3所示,0.25mmol/L BS3交联所示。
BS3能区分单体和寡聚体状态的Aβ1-42,且3种蛋白在条带上存在明显的差异性,单体交联后以单体、3聚、4聚3种形式出现,与未交联的ADDL相比,ADDL的四聚体增多,而原纤维形式的Aβ1-42,4聚体没有增多,却出现较大的寡聚形式,停留在分离胶入口处。戊二醛很容易导致Aβ1-42“过度”交联,从而难以比较Aβ1-42 3种形式的差别。
冬捕2.3 电镜分析戊二醛、BS3对Aβ1-42的交联情况
使用透射电镜(TEM)观察Aβ1-42的单体、ADDL及原纤维三种形式的交联情况如图4,分别是未交联、0.3mmol/L戊二醛及BS3交联过的Aβ1-42样品,Aβ1-42单体直径仅为1nm,电镜很难观察到,但戊二醛交联后的Aβ1-42出现寡聚。由图4可以看出,BS3交联以后,蛋白有明显的聚集,而戊二醛的交联明显要严重，即BS3对Aβ1-42的交联很“温和”，与上述电泳结果相符合。
综合以上电泳和电镜结果,可以发现BS3对Aβ1-42的电泳电镜分析均能起到固定状态的效果,
其作用主要有以下几个方面:①BS3适度交联,可以在Tris-Tricine电泳中识别出Aβ1-42单体、ADDL及原纤维等形态;②相对于戊二醛的交联,BS3显得更合适,不会导致过度交联寡聚物的产生;③BS3交联后使用电泳分析,可以得到与电镜相支持的结果。
可溶性Aβ寡聚体在AD的病源学过程中起着很重要的作用。2003年JBC曾专门报道如何控制Aβ蛋白的单体和寡聚体状态[14],这成为Aβ1-42单体处理的标准方法。人们还对除Aβ以外的一些易聚集蛋白进行寡聚检测,如α-突触核蛋白,IAPP等[11,17],以显示它们可能存在共同的毒性机制。本文选用最常用的两种常见寡聚体ADDL和protofibril进行实验。
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戊二醛作为交联剂曾被报道,然而在Aβ状态分析的实验中,发现戊二醛容易过度交联,即使很低的交联剂浓度和很短的交联时间,单体状态的蛋白也会产生严重聚集,这就不能达到分析Aβ状态的目的,BS3对蛋白的交联相对“温和”,不容易对Aβ1-42单体产生过度交联,结果如图2，3所示。BS3提高到1.2mmol/L,结果却并没有0.3mmol/L浓度明显,这是因为1.2mmol/L交联剂加入后,形成大的聚集体可能并未进入胶内,此外在染过程中,整块丙烯酰胺胶处在培养皿中作旋转摇动,中间部分具有一定的银染优势.而边沿条带染料容易被洗脱。
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