该文研究组方相同配比不同的6个开心散类方对阿尔茨海默病（AD）模型小鼠学习记忆能力的改善作用，以及对阿尔茨海默病模型小鼠海马中的海马中脑源性神经营养因子（BDNF），Tau蛋白，pTau蛋白，Aβ，乙酰胆碱（Ach），乙酰胆碱酯酶（AchE）及血清中N端前脑钠肽前体（NTproBNP）的影响，选用昆明小鼠，腹腔注射D半乳糖和亚硝酸钠，建立阿尔茨海默小鼠模型后，连续灌胃35 d，其中阳为石杉碱甲（005 mg·kg-1），各开心散类方给药组高、中、低剂量分别为3570，1785，0892 g·kg-1，采用Morris水迷宫评价各组动物学习记忆能力；Western blot方法检测各组小鼠海马中BDNF的含量；Elisa方法检测各组小鼠海马中Tau蛋白，pTau蛋白，Aβ，Ach，AchE及血清中NTproBNP的含量。结果显示，《千金要方·卷十四》之开心散显著改善AD模型小鼠学习记忆能力，明显升高其海马中BDNF，Ach含量，显著降低其海马中AchE，Aβ，Tau蛋白，pTau蛋白，NTproBNP含量，作用最为全面，在Tau蛋白方面作用较突出；《医心方》之开心散、《医门方》之开心丸、《备急千金要方》之定志小丸和《古今录验》之定志丸对AD模型小鼠各指标的影响各有侧重，部分剂量显著优化了评价学习记忆能力的各项指标，明显升高AD模型小鼠海马中BDNF，Ach含量，显著降低AD模型小鼠海马中Aβ，Tau蛋白，pTau蛋白含量及AchE活性， 明显降低AD模型小鼠血清中NTproBNP含量，作用较为显著；《千金翼》之补心汤的高、中、低剂量均基本未见其对阿尔茨海默病模型动物的影响。结果表明，《千金要方·卷十四》之开心散对阿尔茨海默病模型小鼠的作用最为全面，且在Tau蛋白方面的作用较为突出。
标签：开心散类方；阿尔茨海默病；阿尔茨海默病小鼠模型；Tau蛋白
[Abstract]The efficacy of Chinese herbal formulas in treating Alzheimer has been proved in many studies In this study， six different Kaixin San formulas were compared to investigate their effects on learning and memory decline， brainderived neurotrophic factor （BDNF） in the hippocampus， tau protein， acetylcholinesterase （AChE） and Nterminal probrain natriuretic peptide （NTproBNP） Kunming mice were selected and established a mouse model of Alzheimer′s by intraperitoneal injection of Dgalactose and sodium nitrite， continued intragastric 4 weeks， using the ability of learning and memory in Morris water maze test to evaluate the animals in each group； the content of BDNF in the hippocampus of mice with Western blotting detected； ELISA method for th
e detection of each group of mice hippocampal tau protein，pTau protein， Aβ，Ach，AchE and serum NTproBNP levels The results showed that， Kaixin San of Qianjin Yaofang three dose recorded significantly improved learning and memory ability of mice； increased the content of BDNF and Ach in the hippocampus； decreased the content of Aβ， Tau protein， pTau protein in the hippocampus； high， middle dose significantly decreased the serum NTproBNP and AchE in hippocampus， the effect is most significant Part dose of Kaixin San of Yixin Fang， Kaixin Wan of Yimen Fang， Dingzhi Xiaowan of Beji Qianjin Yaofang and Dingzhi Wan of Guji Luyan could improve the learning and memory ability evaluation indicators， significantly increased BDNF and Ach in the hippocampus of AD model mice， reduced the Aβ， Tau protein， pTau protein in hippocampus of AD model mice， decreased the NTproBNP and AchE in serum of AD mice， the effect is more significant Three does of Buxin Tang of Qianjin Yi had no effects of treatment in Alzheimer′s disease The results showed the treatment in AD of Kaixin San of Qianjin Yaofang is the most significant[Key words]Kaixin San formulas； Alzheimer； Alzheimer disease mouse model； Tau protein中国医药指南
窄带钢
doi：10.4268/cjcmm20160718
阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种进行性中枢神经系统退行性疾病，其主要临床表现为记忆力减退、认知障碍及人格改变等。据流行病学研究表明，该病的发病阶段与年龄有着一定的联系，而随着我国人口寿命的延长和社会老龄化的加剧，阿尔茨海默病的发病率明显上升，其致死率仅次于心脑血管疾病、肿瘤和脑卒中，成为威胁老人健康的最严重疾患之一[12]。麻油姜末炒鸡蛋
开心散类方始载于唐代孙思邈的《千金要方·卷十四》，由远志、人参、茯苓、石菖蒲4味药材组成，还包括了《医门方》之开心丸、《备急千金要方》之定志小丸、《古今录验》之定志丸、《医心方》之开心散和《千金翼》之补心汤，主要有益智、调节情志、防老抗衰等功效，其药方组成完全相同但配伍比例不同，功效亦有不同（表1）。 前期的研究表明，6种开心散类方对Aβ2325损伤的 PC12细胞均有保护作用，有潜在阿尔茨海默病的作用，《千金要方·卷十四》之开心散作用最为显著[3]，《备急千金要方》之定志小丸可明显改善东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍，增强小鼠学习记忆的能力[4]。
AD的发病机制尚不明确，主要有胆碱能学说、β淀粉样蛋白学说、Tau蛋白学说、血管因素
学说等。本文将通过观察6种开心散类方对AD模型小鼠的学习记忆能力的影响，以及对与AD可能的发病机制相关学说进行初步探讨，如海马中脑源性神经营养因子（BDNF），乙酰胆碱（Ach），乙酰胆碱酯酶（AchE），Aβ，Tau蛋白，pTau蛋白，血清中N端前脑钠肽前体（NTproBNP）的影响，评价6个类方对阿尔茨海默症模型小鼠的影响。
1材料
健康SPF级昆明小鼠210只，雌雄各半，入组时体重18～22 g，中国人民解放军总医院动物中心提供，合格证号11400700084097。
人参、远志、茯苓、石菖蒲购自北京同仁堂药材有限责任公司，6种开心散类方粉剂均由中国中医科学院中药研究所制剂中心提供，《千金要方·卷十四》之开心散011 g干粉/g生药、《医门方》之开心丸019 g干粉/g生药、《备急千金要方》之定志小丸021 g干粉/g生药、《古今录验》之定志丸023 g干粉/g生药、《医心方》之开心散017 g干粉/g生药和《千金翼》之补心汤021 g干粉/g生药，使用时按比例配成药液；石杉碱甲胶囊（批号130501）由上海复旦复华药业有限公司生产；D半乳糖（批号20140117）购于国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠（许可证号XK1320100153）购于西陇化工股份有限公司；BDNF一抗
电子顺磁共振（货号SC546）购于Senta公司；Tau蛋白，pTau蛋白，Ach，AchE，Aβ，NTproBNP ELISA试剂盒均购于R&D公司。
Morris水迷宫（上海移数公司）；DNM9602G酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司）；3K15低温离心机（美国Sigma公司）；VC150超声破碎仪，涡旋混合仪（SCI logex公司）；UVP凝胶成像系统EC3 Imaging System（美国BIORAD公司）。
2方法
21分组、造模及给药所有小鼠适应环境3 d后，通过Morris水迷宫实验排除个体差异，筛选出170只小鼠（雌雄各半），随机选取10只作为正常组，其余小鼠作为AD模型组。正常组动物腹腔注射等体积生理盐水，模型组动物每日腹腔注射D半乳糖120 mg·kg-1和亚硝酸钠45 mg·kg-1，连续60 d后，将模型小鼠随机分为模型组，阳性对照组，以及6个开心散类方高、中、低剂量组，正常组和模型组每天灌胃25 mL· kg-1蒸馏水，阳性对照组给药剂量为005 mg·kg-1，各开心散类方给药组高剂量为每天3570 g·kg-1，中剂量为1785 g·kg-1，低剂量为0892 g·kg-1，Morris水迷宫测定期继续给药，共给药35 d。模型组与各给药组给药同时每日进行腹腔注射D半乳糖120 mg·kg-1和亚硝酸钠45 mg·kg-1，正常组腹腔注射等体
积的生理盐水。
22Morris水迷宫训练及测试造模60 d后和给药30 d后的第1天至第4天为Morris水迷宫训练，每天训练1次，于第5天进行定位导航试验，利用行为学分析软件记录小鼠60 s内到平台所需的时间（即逃避潜伏期）；第6天撤出平台，进行空间探索试验，记录小鼠在60 s内穿越原平台所在位置的次数（穿越平台次数）、第3象限（即目的象限）游泳路程及游泳总路程。计算得出目的象限游泳路程百分比=目的象限游泳路程/游泳总路程。
23采集样品及相关物质测定行为学试验结束后，立即对小鼠麻醉进行摘眼球取血，迅速在冰上剥离海马，置于冻存管中，-80 ℃冻存，待测。将血在室温静置一段时间后，4 ℃ 3 000 r·min-1离心10 min，取上层血清置于-80 ℃冻存，待测。Western blot法测定各组动物海马中BDNF的表达水平，用BCA试剂盒进行蛋白定量检测。将各组蛋白调成等浓度，并加入上样缓冲液，用12% SDSPAGE分离胶和5% SDSPAGE浓缩胶电泳分离后，转移到02 μm BVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，孵一抗（1∶200），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗室温摇床90 min，TBST洗膜3次，每次10 min，用UVP凝胶成像系统得出条带，并计算目的蛋白与内参βacting的吸光度（A）比值；按ELISA试剂盒说
明书测定各组动物海马中Tau蛋白，pTau蛋白，Ach，AchE和Aβ的含量以及各组动物血清中NTproBNP的含量24数据统计处理实验数据使用SPSS 200统计软件处理，采用单因素方差分析，组间差异采用Dunnet′s检验，计量资料数据用±s表示，以P＜005有统计学意义。
3结果
31对各组小鼠定位导航试验的影响腹腔注射D半乳糖和亚硝酸钠后，模型组小鼠的潜伏期明显升高，与正常组相比有显著性差异（P＜005）；给药后，与模型组相比，阳性对照组和各开心散类方高、中剂量组小鼠潜伏期均有不同程度的降低，其中《千金要方·卷十四》之开心散的高、中剂量，《医门方》之开心丸的中剂量，《备急千金要方》之定志小丸的高剂量，《古今录验》之定志丸的中剂量，《医心方》之开心散的中剂量的潜伏期均明显降低，具有统计学意义，而各组低剂量均未表现出显著性差异（表2）。
西村工人体育场32对各组小鼠空间探索试验的影响Morris水迷宫空间探索试验结果显示，腹腔注射D半乳糖和亚硝酸钠后模型组小鼠穿越平台次数和目的象限游泳路程百分比均明显小于正常组（P＜005）。给药后，与模型组相比较，阳性对照组和各开心散类方高、中剂量组的小鼠穿越平台次数均有不同程度的增加，目的象限游泳路程百分比也均有不同程度的升高。其
中，《千金要方·卷十四》之开心散的高、中剂量，《医门方》之开心丸的高、中剂量，《备急千金要方》之定志小丸的高剂量，《古今录验》之定志丸的中剂量，《医心方》之开心散的高、中剂量的穿越平台次数均明显增加，具有统计学意义（P＜005）。《千金要方·卷十四》之开心散的高、中剂量，《医门方》之开心丸的高、中剂量，《备急千金要方》之定志小丸的高、中剂量，《古今录验》之定志丸的中剂量，《医心方》之开心散的高剂量的目的象限游泳路程百分比均明显增加，具有统计学意义，各组低剂量均未表现出显著性差异（表2）。
33对各组小鼠海马中BDNF含量的影响与正常组相比，模型组小鼠海马中BDNF表达明显降低；nc4400
与模型组相比，阳性组，《千金要方·卷十四》之开心散高、中剂量组，《医心方》之开心散中剂量组，《医门方》之开心丸中剂量组，《备急千金要方》之定志小丸高、中剂量组均能不同程度降低AD模型小鼠海马中BDNF相对含量，具有统计学意义，各组低剂量均未表现出显著性差异（图1）。
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