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【摘要】氨基酸序列是蛋白质和多肽重要的结构，其决定蛋白质的高级结构。氨基酸测序在蛋白质研究中越发重要，高分辨率质谱技术的发展大大促进了氨基酸测序的研究。本文综述了氨基酸测序的方法、原理以及其应用的研究进展，随着质谱技术的不断发展，新的测序方法不断建立，氨基酸测序将在蛋白质研究中发挥更大的作用。 【关键词】蛋白质；氨基酸测序；质谱技术；从头测序
蛋白质是一类最重要的生物大分子，在生物体内占有特殊的地位。其一级结构是由多肽链主链上共价连接的氨基酸残基决定的，二级结构和其它高级结构主要是由非共价力如氢键、离子键、范德华力和疏水作用决定的。一级结构中氨基酸序列的排列决定蛋白质高级结构的生物学活性。因此，氨基酸序列测定具有非常重要的意义。
氨基酸序列测定一般需要测定其相对分子质量、等电点、N-末端肽段序列和C-末端肽段序列，虽然测定每种蛋白质的氨基酸序列都有自己特殊的问题需要解决，但是氨基酸测定的一
般方法都可以概括为：①测定蛋白质分子中多肽链的数目，根据蛋白质N-末端或C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量可以确定蛋白质分子中的多肽数目；②拆分蛋白质分子的多肽链，断开多肽链间的二硫键，如果蛋白质分子是由一条以上多肽链构成的，则这些链必须加以拆分；③鉴定多肽链的N-末端残基和C-末端残基，裂解多肽链成较小的片段，测定各肽段的氨基酸序列，目前最常用的肽段测序方法有Edman降解法[1]、酶解法和质谱法；④运用软件重建完整多肽链的一级结构，确定二硫键的位置，利用两套或多套肽段的氨基酸序列彼此间交错拼凑出完整多肽链的氨基酸测序。目前氨基酸序列测定的方法主要有化学降解法、酶降解法和质谱法以及核苷酸序列的推定法，每种方法都有其自身的优势和劣势，以前面三种测序方法最为常用。
1化学降解法
化学降解法是指蛋白质或多肽物质与相应的化学试剂反应后，专一裂解多肽链肽段并检测相关裂解片段的方法，包括N-末端肽段序列测定法和C-末端肽段序列测定法。N-末端肽段序列测定的方法主要有苯异硫氰酸酯（PITC）法，C-末端肽段序列测定的方法主要有（异）硫氰酸法。其它化学方法，如二硝基氟苯（DNFB或FDNB）法、过氟酸酐法[2]等由于并不常用，所以在这里不做介绍。
合成化学
1.1苯异硫氰酸酯（PITC）法1950年，瑞典有机化学家Edman P.[3]首先提出用于鉴定蛋白质或多肽的N-末端氨基酸序列测序的方法—Edman化学降解法[1]，此方法又称为苯异硫氰酸酯（PITC）法，Edman降解法一般分三步进行，包括第一步偶联反应、第二步环化断裂反应和第三步转化反应，即Edman降解试剂（PITC）与多肽链的游离α-末端氨基酸作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质（PTC-多肽或蛋白质），后者在酸性有机溶剂中加热时，N-末端的PTC-氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来，除去N-末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的，因为PTC基的引入只使第一个肽键的稳定性降低。反应液中代表N-末端残基的PTH-氨基酸在紫外区有强吸收，可用气相谱、薄层层析和质谱等检测技术进行鉴定。
1.2（异）硫氰酸法1926年，Schlack和Kumpf[4]提出了用于鉴定蛋白质或多肽的C-末端氨基酸序列测定方法—Schlack-Kumpf化学降解法，该方法又称为（异）硫氰酸法[5]，与Edman化学降解法原理相似，（异）硫氰酸法一般分四步进行，包括第一步羟基活化、第二步偶联反应、第三步环化反应和第四部裂解反应[6～10]。即异硫氰酸与蛋白质或多肽的α-羧基反应，生成蛋白质或多肽乙内酰硫脲，再用裂解试剂切下C末端的氨基酸残基，生成氨基酸乙内酰硫脲，最后用HPLC、质谱等技术分析游离的氨基酸乙内酰硫脲。
1.3化学降解法在蛋白质测序中的应用随着蛋白质测序技术的快速发展和蛋白质序列分析仪的推出和逐步完善，经典的Edman降解法已经广泛应用于蛋白质的N-端测序，而与N-末端测序相对应的C-末端测序也得到迅速发展。陈文章[11]等在微流控芯片上完成Edman降解反应，大幅度提高Edman降解法测序的灵敏度，并与质谱技术联用，提高痕量蛋白质序列鉴定的准确度。同时通过在微流控芯片上进行一个循环的降解，准确地得到多肽端氨基酸残基的信息，解决了MS/MS谱图内难以辨别b/y系列离子的难题，并成功地完成了三个多肽样品（包括一个C端修饰的神经多肽）的从头测序。Bergman等[12]测定了200多个多肽和蛋白质的C末端序列,在pmol水平能准确测到4～5个氨基酸残基序列。蛋白质或多肽的结构对测序过程会有很大影响,因此,具体能准确测定多少氨基酸残基序列还要视蛋白质及多肽结构而定。
2酶降解法
在蛋白水解酶中有一类酶称肽链外切酶或称外肽酶，如氨肽酶和羧肽酶，他们分别是从肽链N-末端和C-末端逐个地向里切，只要能跟随酶水解的过程分别定量测试释放的氨基酸，便能确定多肽的氨基酸序列，从而达到鉴定蛋白质或多肽序列。
2.1羧肽酶法[13] 羧肽酶是一类肽链外切酶，它专一地从肽链的C-末端开始追个降解，释放出游离氨基酸。被释放的氨基酸数目与种类随反应时间而变化，根据释放的氨基酸数目（摩尔数）与反应时间的关系，便可以知道该肽段的C-末端氨基酸序列。目前测定C-末端残基的各种方法中，以羧肽酶法最为有效，也最常用。常用的羧肽酶有4种，即羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶C以及羧肽酶Y。其中羧肽酶A和羧肽酶B分别来自牛胰和猪胰，羧肽酶C得自柑橘叶，羧肽酶Y取自面包酵母。研究得最多使用最广范的是羧肽酶A和羧肽酶B，羧肽酶A能释放除Pro、Arg和Lys之外的所有C-末端残基，而羧肽酶B只水解以碱性氨基酸Arg和Lys为C-末端残基的肽键。羧肽酶A和羧肽酶B的混合物能释放除Pro以外的任一C-末端残基。羧肽酶C是专门水解肽链羧基端（C端）倒数第二位由Pro形成的的肽键，在一些文献中，并不叫羧肽酶C，而被称为羧肽酶P。羧肽酶Y可以作为于任何一个C-末端残基，它能非特异性地裂解C端包括Pro在内的所有氨基酸残基，并且能酶解乙酰化等修饰的氨基酸残基。
2.2氨肽酶法氨肽酶是一类肽链外切酶或叫外肽酶，它们能从多肽链的N-末端追个地向里切，根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量。实际上此法用于测定N-末端和末端残基序列有许多困难，因为酶对各种肽键的敏感性不一样，常常难以判断哪个
残基在前，哪个残基在后。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，亮氨酸氨肽酶并不是只能水解以Leu为N-末端残基的肽段，而是水解以Leu为N-末端的肽键速度最快。
2.3酶降解法在蛋白质测序中的应用
共轭亚油酸
1.
末端测序过程中，经常会碰到N-末端残基的氨基酸被封闭，使其不能与Edman降解试剂发生作用。N-末端残基受封闭的种类有很多，如焦谷氨酰环化、乙酰化以及某些环化。当遇上肽链N-末端是焦谷氨酰残基时，可以使用焦谷氨酰氨肽酶处理，它是专门裂解焦谷氨酰N-末端的外肽酶，N-末端残基的焦谷氨酸可以用层析法来鉴定，剩下的肽链可以使用Edman降解法进行鉴定。在用酶降解法测序C-末端肽段中，曾嵘等[1中国大学及学科专业评价报告4]采用此方法,以乙酸酐为活化试剂,四丁铵硫氰酸为偶联试剂,溴甲基萘为烷化试剂,将多肽或蛋白质的C端序列依次裂解为ATH-氨基酸进行检测。他们对20多种重组或天然的多肽或蛋白质进行了C末端肽段序列分析,获得了不同长度的C末端肽段序列信息,一般可在1nmol水平上准确测定3～5个氨基酸残基,最多可准确测定达10个以上氨基酸残基。
3质谱法
质谱（MS）法是一种化学分析形式，用于测量样品中原子或分子的质荷比（m/z）。它还能区分同一元素的同位素。根据质谱仪的类型，这些测量通常可用于确定样品组分的确切分子量并鉴定未知化合物组成。基于质谱数据的蛋白质鉴定算法的不同，可以将质谱法主要分为两类：传统的数据库搜索比对和肽段从头测序。在传统测序中，往往只能检测蛋白消化后的部分肽段序列，再用这些肽段序列与已知的蛋白数据库进行比对，根据一定算法打分，推算出可能性高的蛋白和序列。蛋白质从头测序法的一大特点就是可以不借助任何数据库信息，直接对蛋白质的序列进行分析。相比传统的质谱数据库搜索法有着不可比拟的优势，可以应用于分析新物种的蛋白质序列，以及基因组未被测序的物种的蛋白质序列。
3.1传统数据库比对蛋白质测序方法质谱技术由于具有高灵敏度、高准确性、高通量、高分辨率、耐盐性、耐杂质性和谱图解析简单等优点已被广泛用于蛋白质鉴定和蛋白质组学等方面的研究。尤其是电喷雾（electraspray ionization，ESI）和基质辅助激光解吸电离-飞行时间（matrix-assisted laserd desorption/ionization time-of-fight，MALDI-TOF）的出现，使质谱技术在蛋白质结构和功能分析中发生了革命性的飞跃。
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3.1.1电喷射电离质谱法（ESI-MS）电喷射电离质谱法（ESI-MS）父子tck[15]是蛋白质溶液在高电场中通过毛细管静电分散成携带高电荷的微液滴，然后蛋白质离子微滴以喷雾的形式进入气相，最后进入串联质谱分析仪。串联质谱允许蛋白质离子在两台串联在一起的质谱仪上进行分析。第一台质谱仪用于从蛋白质水解液中分离寡肽，然后选出每一寡肽进行下一步分析，在进入第二台质谱仪的过程中，选出的寡肽于碰撞池中通过与氮气或氩气分子碰撞裂解成离子碎片，这些碎片被吸引入第二台质谱仪中进行分析。裂解主要发生在寡肽中连接相继氨基酸的肽键上，因此产生的碎片是只差一个氨基酸残基的肽键的相对分子质量。这样加上被裂解掉残基R基相对分子质量，其范围从1（Gly）到130（Trp）。由于这个差值是按时间的各个特征值，因此可以根据离子碎片的质量差值来推定氨基酸序列，其中亮氨酸和异亮氨酸分离需要另做处理才能分开。
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