一．实验目的
1.学习荧光分析法的基本原理和操作；
2.熟悉荧光分析法进行多组分含量的测定彭树杰方法。
二．实验原理
1、荧光分析法原理：
当被测物质受到光照后，被测物分子吸收了具有特征频率的辐射能，分子从基态上升到激发态，分子在较高能级的激发态时，它可能处于激发态中各种振动状态的一种。然而由于分子通过与溶剂分子、同类分子或其他分子的碰撞，而失去振动能级，降低至激发态时的最低振动能级，在此过程中并不发光。但当分子从激发态的最低振动能级，即第一电子激发态的最低振动能级跃迁至基态的各个不同的振动能级时， 则以光的形式辐射出能量，所辐射出的光既是荧光。
激发光谱：
荧光是光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，这可以从它们的激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时，选择荧光的最大发射波长为测量波长，改变激发光的波长，测量荧光强度的变化。以激发波长为横坐标、荧光强度为纵坐标作图，即得到荧光化合物的激发光谱。激发光谱的形状与吸收光谱的形状极为相似，经校正后的真实激发光谱与吸收关顾不仅形状相同，而且波长位置也一样。这是因为物质分子吸收能量的过程就是激发过程。 发射光谱：
发射光谱简称荧光光谱。如果将激发光波长固定在最大激发波长处，然后扫描发射波长，测定不同发射波长处的荧光强度，即得到荧光光谱。
3、试验方法机理：
邻- 羟基苯甲酸（亦称水杨酸）和间 - 羟基苯甲酸分子组成相同，均含一个能发射荧光的苯环，但因其取代基的位置不同而具有不同的荧光性质。在pH=12 的碱性溶液中，二者在 310nm附近紫外光的激发下均会发射荧光；在pH=5.5的近中性溶液中，间-羟基苯甲酸不发荧光，邻-羟基苯甲酸因分子内形成氢键增加分子刚性而有较强荧光，且其荧光强度与pH=12时相同。利用此性质，可在pH=5.5 时测定二者混合物中邻-羟基苯甲酸含量时，间-羟基苯甲酸不干扰。另取同样量混合物溶液，测定pH=12 时的荧光强度，减去 pH=5.5时测得的邻-羟基苯甲酸的荧光强度，即可求出间-羟基苯甲酸的含量。已有研究表明，二者的浓度在0～ 12μg/mL 范围内均与其荧光强度呈良好的线性关系，且对-羟基苯甲酸在上述条件下均不会发射荧光，不会干扰测定，故而亦可在邻-羟基苯甲酸、间-羟基苯甲酸、对-羟基苯甲酸三者共存时，用上述方法测定出邻 -羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸的含量。
三．主要仪器和试剂
1、仪器：
罗辑课荧光分光光度计、1cm石英样品池、 10mL比管、吸量管、容量瓶、烧杯、吸耳球。
2、试剂：
邻- 羟基苯甲酸标准溶液：100 μg / mL (水溶液 )；间-羟基苯甲酸标准溶液：100 μg / mL（水溶液）；HAc-NaAc 缓冲溶液： 47gNaAc 和 6g 冰醋酸溶于水并稀释至1L，得 pH=5.5 的缓冲溶液；NaOH 水溶液； 0.1mol/L；乙醇（95滚球法%）；医用水杨酸软膏。
四．实验内容
1.配制标准系列和未知溶液
分别移取 1.00ml 、2.00ml 、3.00ml 、4.00ml 和 5.00ml 邻- 羟基苯甲酸标准溶液于已知编号的 10mL 比管中，各加入1.0 mL pH5.5 的 HAc-NaAc 缓冲液，用去离子水稀释至刻度，摇匀备用。
另外分别移取 1.0ml、2.00ml 、3.00ml 、4.00ml 和聆听的魅力 5.00ml 间- 羟基苯甲酸标准溶液于已编号的 10mL 比管中，各加入 1.00 mL 0.1mol/L 的 NaOH水溶液，用去离子水稀释至刻度，摇匀备用。
2．样品溶液配制
取约0.2g水杨酸软膏，加50%乙醇约25ml，振摇使水杨酸溶解，放冷至室温，用定性滤纸过滤除去ZnO,用蒸馏水稀释至500ml，用吸量管准确移取1.00ml该样品溶液于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，用于样品测定。
取上述溶液各 1.00mL 于 10mL 比管中，其中一份加入 1.00mL pH5.5 盐酸利多卡因的 HAc-NaAc缓冲液，另一份加入 1.00mL 0.1mol/L 的 NaOH水溶液，均用去离子水稀释至刻度，摇匀备用。
3.打开氙灯光源，后打开光度计主机光源，再打开计算机主机光源，预热15min。
4.设定激发狭缝，发射狭缝，扫描速度，扫描波范围和灵敏度档。
新课程理论5.荧光激发光谱和发射光谱的测定，选取激发光长和发射波长。
6.测量各标准系列溶液荧光强度，绘制标准曲线。
7.测量未知溶液的荧光强度，由标准曲线求出样品中邻-羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸的含量。
8.实验完毕，先关闭主机和显示器电源，再关闭光度计主机光源，最后关闭氙灯光源。
五．思考题
1.λex和λem各表示什么含义？测量未知试样时，其激发波长和发射波长如何获得？为什么对某种组分其λex和λem应该基本相同？
λex是指荧光最大激发波长，λem是指荧光最大发射波长
未知试样，不知最佳激发波长，可以先用能量较高能保证它激发的波长进行扫谱，得到一条发射谱线。从发射谱线上可以得到一个峰值。再以此峰值作为发射波长，反过来扫激发光谱。又可得一峰值，即为最佳激发波长。
以最佳激发波长进行激发,可以得到最优的发射谱。但一般只要能量足够，能使物质激发，就可以得到发射谱，确定最佳的发射波长。
原子荧光是气态自由原子吸收光源的特征辐射后，原子的外层电子跃迁到较高能级，然后又跃迁返回基态或较低能级，同时发射出与原激发辐射波长相同或不同的辐射，从上述荧
光强度的定义，可知只有在荧光的最大激发波长和最大发射波长基本相同时，测定的灵敏度才会体到最高值。
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