定义：紫外可见分光光度法：根据被测量物质分子对紫外-可见波段范围（150～800纳米）单辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法； 分子荧光光度法：利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。可以从发射光谱或激发光谱进行分析。
组成部件：紫外可见分光光度法：①辐射源。必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围350～2500纳米），氘灯或氢灯（180～460纳米），或可调谐染料激光光源等。
②单器。它由入射、出射狭缝、透镜系统和散元件（棱镜或光栅）组
成，是用以产生高纯度单光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单光和分出所需的单光束。③试样容器，又称吸收池。供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。容器的光程一般为 0.5～10厘米。④检测器，又称光电转换器。常用的有光电管或光电倍增管。。⑤显示装置。
这部分装置发展较快。较高级的光度计，常备有微处理机、荧光屏显示和记录仪等，可将图谱、数据和
操作条件都显示出来。
分子荧光光度法：激发光源、单器、样品池、检测器和记录显示部分。
1. 光源能发射紫外到可见区波长的光、强度大、稳定。常用的有溴钨灯、
高压汞灯、氙灯。2. 单器，两个单器。3. 样品池通常用石英制成。
4. 检测器：光电倍增管。
常见类型：紫外可见分光光度法：1.单光束。简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器
具有很高的稳定性。 2.双光束自动记录，快速全波段扫描。可消除
光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。
仪器复杂，价格较高。3.双波长。将不同波长的两束单光(λ1、λ
) 快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需
2
参比池。△ =1～2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。
分子荧光光度法：1. 光电荧光计用滤光片作单器（激发滤光片
和荧光光片），溴钨灯或高压汞灯作光源，光电管为检测器。2. 荧光
分光光度计用氙灯作光源、光栅作单器，光电倍增管为检测器。
可连续扫描激发光谱和荧光光谱。
原理：紫外可见分光光度法：紫外 - 可见吸收光谱通常由一个或几个宽吸收谱带组成。最大吸收波长（λmax）表示物质对辐射的特征吸收或
选择吸收，它与分子中外层电子或价电子的结构（或成键、非键和
反键电子）有关。朗伯-比尔定律是分光光度法和比法的基础。这
个定律表示：当一束具有I0强度的单辐射照射到吸收层厚度为b，
浓度为c的吸光物质时，辐射能的吸收依赖于该物质的浓度与吸收层
的厚度。其数学表达式为：式中的A叫做吸光度；I0为入射辐射强
度；I为透过吸收层的辐射强度；（I／I0）称紫藤为透射率T；ε是
一个常数，叫做摩尔吸光系数，ε值愈大，分光光度法测定的灵敏
度愈高。
分子荧光光度法：分子吸收能量后，从基态最低振动能级跃迁到第一
电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级（这一过程速度很快，
大约10-15 s），成为激发单重态分子。激发态分子不稳定，可以通过
以下几种途径释放能量返回基态。1. 振动驰豫。这一过程只能发生
在同一电子能级内，即分子通过碰撞以热的形式损失部分能量，从较
高振动能级下降到该电子能级的最低振动能级上。由于这一部分能量
以热的形式释放，而不是以光辐射形式发出，故振动驰豫属于无辐射
跃迁。 2. 内转换。即激发态分子将多余的能量转变为热能，从较
高电子能级降至较低的电子能级。内转换也属于无辐射跃迁。3. 荧
光
较高激发态分子经无辐射跃迁降至第一电子激发单重态的最低振动
能级后，仍不稳定，停留较短时间后（约10-8 s，称作荧光寿命），
以光辐射形式放出能量，回到基态各振动能级，这时所发射的光称为摆线
荧光。当然也可以无辐射跃迁形式返回基态。 4. 系间窜跃有些物
质的激发态分子通过振动驰豫和内转换下降到第一电子激发态的最
低振动能级后，有可能经过另一个无辐射跃迁转移至激发三重态，这
一过程伴随着自旋方向的改变，称为系间窜跃。对于大多数物质，系
间窜跃是禁阻的。如果分子中有重原子（如I、Br等）存在，由于自
旋-轨道的强偶合作用，电子自旋方向可以改变，系间窜跃就变得容
易了。荧光的检测：光源发出的紫外可见光通过激发单器分出不
同波长的激发光，照射到样品溶液上，激发样品产生荧光。样品发出
的荧光为宽带光谱，需通过发射单器分光后再进入检测器，检测不
同发射波长下的荧光强度F。由于激发光不可能完全被吸收，可透过
溶液，为了防止透射光对荧光测定的干扰，常在与激发光垂直的方向
检测荧光（因荧光是向各个方向发射的）。激发与荧光光谱的形成：
任何荧光物质，都具有两种特征光谱，即激发光谱(excitation
spectrum)和荧光发射光谱(fluorescence emission spectrum)。
荧光光谱，又称发射光谱。保持激发光波长不变（即固定激发单
器），依次改变荧光发射波长，测定样品在不同波长处发射的荧光强
度F。以发射波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，得到荧
光发射光谱。荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最
大发射波长。
灵敏度：紫外可见分光光度法：灵敏度很高，达0.00001-0.0000001mol/L；
分子荧光光度法：由于分子荧光是从入射光的直角方向入射，因而灵
敏度要比紫外可见高2-4个数量级，它的测定下限
在 0.1-0.001ug/mL。
选择性：紫外可见分光光度法：一个物质若含有生基团，它就会产生紫外和可见吸收，反过来根据紫外-可见吸收光谱便可判断某些官能团的存
在，即进行官能团的鉴别，紫外-可见吸收光谱的获得是建立在测定出
物质对不同波长光（单光）吸收的基础上的。选择性较高。
分子荧光光度法：一个物质只要能产生荧光，则可以根据荧光光谱判
别物质的种类（前提是量子产率达到要求），因而选择性较高，但由
于不是所有物质都有荧光光谱，应用有一定限制。
影响因素：紫外可见分光光度法：1.共轭效应，共轭效应越强，能量差越小，最大吸收波长想长波方向，吸收强度也增大。2.立体化学校应，包括
空间位阻和跨环效应，均有影响。3.溶剂的影响，在溶液中物质是溶
剂化的，影响了溶质分子的自由转动，引起光谱结构精细结构的消失。
4.体系PH的影响，无论是酸性碱性，体系的PH对紫外可见光谱的影响
是普遍的现象。
分子荧光光度法：1.跃迁类型，物质必须在紫外可见区有强吸收和高
荧光效率才能产生荧光。具有π—π* 跃迁的分子才有强吸收。π—π*
跃迁的ε大。2. 共轭效应：大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或
杂环，具有共轭的π～π* 跃迁。其共轭程度愈大，荧光效率也愈大，
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且最大激发和发射波长都向长波长方向移动，如苯、萘、蒽三种物质。
3.刚性平面结构：当荧光分子共轭程度相同时，分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大。有些物质本身不发荧光或荧光较弱，但和金属离子形成配合物后，如果刚性和共平面性增加，就可以发荧光或增强荧光。如8-羟基喹啉是弱荧光物质，与Mg2+、Al3+等金属离子形成的配合物的荧光增强，利用这一特点可以间接测定金属离子。
4. 取代基团。荧光分子上的各种取代基对分子的荧光光谱和荧光强度都有很
大影响。给电子取代基如—NH
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2、—OH、—OCH
3
、—CN、—NHR、—NR
2
等，能增加分子的π电子共轭程度，使荧光效率提高。而-COOH、—NO2、
—
C=O、—F、—Cl等吸电子取代基，可减弱分子π电子共轭性，使
荧光减弱甚至熄灭。还有一类取代基则对荧光的影响不明显，如—R。
5.温度。温度对被测溶液的荧光强度有明显的影响。当温度升高时，
介质粘度减小，分子运动加快，分子间碰撞几率增加，从而使分子无
辐射跃迁增加，荧光效率降低。故降低温度有利于提高荧光效率及荧
光强度。6. 溶剂：同一种荧光物质在不同的溶剂中，其荧光光谱的位
置和荧光强度可能会有一定的差别，尤其是那些分子中含有极性取代
基的荧光物质，它们的荧光光谱易受溶剂的影响。6.溶液的酸度（pH
值）对荧光物质的影响可以分两个方面： 1．若荧光物质本身是弱酸
或弱碱时，溶液pH值改变，物质分子和其离子间的平衡也随之发生变
化，而不同形体具有其各自特定的荧光光谱和荧光效率。例如苯胺。
2. 对于金属离子与有机试剂生成的荧光配合物，溶液pH值的改变会
影响配合物的组成，从而影响它们的荧光性质。例如Ga3+离子与邻-二
羟基偶氮苯，在pH3～4的溶液中形成1:1配合物，能产生荧光。而在
pH6～7的溶液中，则形成1 2的配合物，不产生荧光。
误差来源：紫外可见分光光度法：偏离比尔定律、仪器本身的测量误差。偏离比尔定律的原因：1，比尔定律本身的局限，仅在单光下成立。2，
非单入射光引起的偏离。比尔定律仅在入射光为单光时才成立
事实上单器很难将光源的连续光散成其正的单光，而是具有较
窄波长范围的复合光，光通量为0.01～5nm 。还有溶液的化学偏离。
由于被测物质在溶液中发生缔合、离解、互变异构，生成逐级配合物
等化学原因造成对比尔定律的偏离。
分子荧光光度法：荧光熄灭：由于荧光物质分子间或与其它物质相互
作用，引起荧光强度显著下降的现象叫做荧光熄灭（quenching）或
猝灭。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂，如卤素离子、重金属离
子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化合物等。
注意事项：紫外可见分光光度法：显温度，显时间，溶剂的影响，合适的PH。
分子荧光光度法：激发波长的选择，激发时间的选择，常闭物质的选
择等。
分析方法：紫外可见分光光度法：定性分析：根据吸收光谱的形状，吸收峰的数目，用经验规则计算λmax，与测定的λmax比较；比较未知物与标准
物质在相同化学环境与测量条件下的紫外-可见吸收光谱，若吸收光
谱的形状、吸收峰的数目、εmax(λ)、λmax完全相同，就可以确定
钢筋混凝土容重未知物与标准物质具有相同的生团与助团，但并不能断定两者为
同一化合物。结构分析：根据官能团特征波普来判断。定量分析：比
尔定律，可利用工作曲线求解，多组分同时测定时，可用吸光度加和
性求解。
分子荧光光度法：定性分析：荧光物质的特征光谱包括激发光谱和荧
光光谱，因此用它鉴定物质比吸收光谱可靠。定量分析：标准曲线法
KINGXCON和直接比较法。
应用： 紫外可见分光光度法：无机阴、阳离子的测定
利用高灵敏、高选择性的有机显剂，与被测无机离子发生配合或氧
化还原反应，可测定周期表中绝大多数元素。两组分的同时测定
例：临床中麻醉剂：普鲁卡因丁卡因注射液
它含有两种成分：盐酸普鲁卡因和盐酸丁卡因
这两种化合物结构相似，最大吸收波长分别为291和312nm 。但盐酸
丁卡因的毒性比前者大10倍，因此配制时应严格限制其含量，可采
用双波长，利用吸光度具有加和性来测定和求解，以减少二种化合物
吸收峰重叠而产生的测量误差。有机化合物的定量分析
直接法。若有机化合物本身在结构上含有双键或芳环，即含有共轭电
子，则可直接测定其含量。如微量氨基酸的测定。氨基酸的吸收波长
在280nm 左右，且ε 较小，低含量的氨基酸很难用直接法准确测定。
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可用茚三酮与各种氨基酸反应，生成无还原型茚三酮，过量的茚三
酮又与还原型茚三酮和氨缩合生成紫蓝产物，称为Ruhemann 紫，
l max =570nm ，利用此反应可测微量的氨基酸。
分子荧光光度法：有机物的荧光分析：由于荧光分析的高灵敏度、高
选择性，使它在医学检验、卫生检验、药物分析、环境检测及食品分
析等方面有广泛的应用。
芳香族及具有芳香结构的物质，在紫外光照射下能产生荧光。因此，
荧光分析法可直接用于这类有机物的测定，如：多环胺类、萘酚类、
嘌呤类、吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸及蛋
白质等，约有200多种。食品中维生素含量的测定是食品分析的常规
项目，几乎所有种类的维生素都可以用荧光法进行分析。多环芳烃普
遍存在于大气、水、土壤、动植物及加工食品中，大家所熟知的苯并
[a]芘是致癌活性最强的一种，通过萃取或谱分离后，可采用荧光
法进行测定。该方法准确可靠，测定最低浓度可达 0.1 g/ml 。应用
实例：食品中VB 2
（核黄素）的测定 其测定原理是VB 2在440～500 nm 波长的光照射下，发出黄绿荧光，在波长525 nm 下测定其荧光强
度，在稀溶液中其荧光强度与VB 2的浓度成正比。为消除试液中共存
荧光杂质的干扰，可在测定过荧光强度的溶液中加入连二亚硫酸钠
（Na 2S 2O 4），将VB 2还原为无荧光的物质，然后再测定试液中残余的荧
光杂质的荧光强度，两者之差即为食品中VB 2的荧光强度。该方法被
作为食品分析的国家标准分析方法。
无机元素的荧光分析： 能产生荧光的无机物较少，对其进行分析通
常是将待测元素与荧光试剂反应，生成具有荧光特性的配合物，进行
间接测定。目前利用该法可进行荧光分析的无机元素已近70种。常
见的有铬、铝、铍、硒、锗、镉等及部分稀土元素。例如Al 3+与桑
素或8-羟基喹啉的配合物就可产生荧光，从而用于铝的测定。有些元
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