1、目的与要求
1． 加深对紫外可见分光光度计和荧光光度计原理的理解;
2． 巩固紫外可见分光光度计和荧光光度计的基本操作。
2、方法原理
紫外可见分光光度计
分子的紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量。 时间是一把剪刀根据Lambert-Beer定律说明光的吸收与吸收层厚度成正比，比耳定律说明光的吸收与溶液浓度成正比；如果同时考虑吸收层厚度和溶液浓度对光吸收率的影响，即得朗伯-比耳定律。即
A=εbc，(A为吸光度,ε为摩尔吸光系数，b为液池厚度，c为溶液浓度)就可以采用标准曲线法对溶液进行定量分析。
荧光光度计
物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即If=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
激发荧光物质的激发波长的选择通常为其最大吸收波长。
紫外、荧光光度计均由5个部件组成：①辐射源。②单器。③样品室。对紫外分为石英池
和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。④检测器，又称光电转换器。⑤显示装置。
1. PE LAMBDA 35 型紫外可见分光光度计
2. F7000型荧光光度计
3．试剂：甲基红、乙醇
四、内容与步骤
1．配制一定浓度的甲基红的乙醇溶液（约10-5 mol/L）。
2．甲基红激发波长的确定
1开机
1.1 开光谱仪电源和计算机电源。
1.2 待分光光度计自检完毕在计算机上双击 Lambda 35 图标。
1.3 屏幕将出现UV WinLab的应用窗口，仪器开始初始化，直到显示instrument ready，便可选用适当方法进行分析操作。
2 在methods栏中设定方法
2.1在扫描(SCAN)中设定参数，逐项按需要选用或填入。
2.2 方法编辑完成后在工作站界面按SETUP联机，将仪器调整到所需状态，SETUP键消失同时START键变成绿，提示光度计已准备好运行。
2.3用鼠标点按START键，光度计开始运行所设定的方法，同时START键变成红的STOP键。
2.4 按系统提示放入参比溶液或样品进行检测。
3 记录最大吸收波长及对应的吸光度。
4 文件保存：在file下点击copy to clipboard直接保存图形。或点击save as黑白花奶牛保存横纵坐标在国家财政拨款origin软件里作图。
5 先关软件再关紫外仪器，后关闭计算机。
3. 甲基红发射波谱的测定。
1、开机：
（1）开启计算机。
（2）开启仪器主机电源。按下仪器主机左侧面板下方的黑按钮（POWER）。同时，观察主机正面面板右侧的Xe LAMP 和RUN指示灯依次亮起来，都显示绿。
2、计算机进入Windows XP视窗后，打开运行软件。双击桌面图标（FL Solution 4.0 for F-7000）。主机自行初始化，扫描界面自动进入。
3、测试模式的选择
（1） 点击扫描界面右侧“Method”。
（2） 在“General”选项中的“Measurement”选择“wavelength scan”测量模式。
（3） 在“Instrument”选项中设置仪器参数和扫描参数。
主要参数选项包括：
1 选择扫描模式“Scan Mode”：Emission（发射光谱）。
2 选择数据模式“Data Mode”：Fluorescence(荧光测量)。
3 设定波长扫描范围。
扫描荧光发射光谱(Emission)：需设定发射光的起始/终止波长（李京姬EM Start/End WL）和荧光激发波长（EX WL）;
4 选择扫描速度“Scan Speed”（通常选240nm/min）。
5 选择激发/发射狭缝（EX/EM Slit）。
6 选择光电倍增管负高压“PMT Voltage”（一般选700V）。
7 选择仪器响应时间“Response”（一般选Auto）。
8 选择“Report”设定输出数据信息及输出数据的起始和终止波长（Data Start/End）。
（4）参数设置好后，点击“确定”。
4、设置文件存储路径
（1）点击扫描界面右侧“Sample”。
（2）样品命名“Sample name”。
（3）选中“□Auto File”， 打√。根管测量仪可以自动保存原始文件和TXT格式文本文档数据。
（4）参数设置好后，点击“OK”。
5、扫描测试
（1）打开盖子，放入待测样品后，盖上盖子。（请勿用力）。
（2）点击扫描界面右侧“Measure”（或快捷键F4），窗口在线出现扫描谱图。
6、数据处理
（1）选中自动弹出的数据窗口。
（2）选择“Trace”，进行读数并寻峰等操作。
（3）使用网络上传数据，禁止使用U盘。
7、关机顺序（逆开机顺序实施操作）：
（1）关闭运行软件FL Solution 2.1 for F-7000，弹出窗口，如图6。管式避雷器
（2）选中“○Close the lamp，then close the monitor windows？”，打“⊙”。
（3）点击“Yes”。窗口自动关闭。同时，观察主机正面面板右侧的Xe LAMP指示灯暗下来，而RUN指示灯仍显示绿。
（4）约十分钟后，关闭仪器主机电源，即按下仪器主机左侧面板下方的黑按钮（POWER）。（目的是仅让风扇工作，使Xe灯室散热）。
（5）关闭计算机。
五、数据记录与处理
1．记录甲基红的吸收光谱，确定其最大吸收波长。
2. 根据吸收光谱确定的最大吸收波长为激发波长记录发射光谱。
六、问题与讨论
激发波长与发射波长有何关系？为什么？
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