荧光分光光度计的使用

实验目的：

掌握荧光分光光度计的基本使用方法、扫描激发光谱、发射光谱、荧光强度等。

掌握荧光定量分析方法。

实验原理：

荧光分光光度计是常用的光学仪器，在定量分析样品的光谱性质表片时经常用到。

荧光分光光度计的基本功能是完成激发光谱，发射光谱的扫描，进行相对荧光强度的测理。从激发光濂可以获得样品激发态能级的分布情况，用来选择定量分析的最佳激发波长。从发射光谱可以知道样品基态能级的分布情况。用来选择定量分析的最佳发射波长。荧光定量分析法的方法与紫外可见吸收光谱类似。但需要注意荧光强度值是相对值。同一样品，同一仪器在不同仪器参数时获得的荧光强度是不同的。只有当测量仪器参数完全相同时，不同的样品荧光强度的相互比较才有意义。

与紫外可见吸收光谱类似，分子荧光光谱也是分子光谱，其谱峰较宽，片片性不是很强。谱峰重叠现象比较普遍。为了减小谱峰宽度。避免谱峰重叠，提高分析的选择性，在定量分析时常采用同步荧光的方法进行。同步荧光是同时扫描荧光分光光度计的激发和发射单仪得到的谱图。通过选择合适的扫描参数。可以使样品谱峰变窄，并避免不同组份的谱峰重叠，得到比较好的分析效果。

同步荧光扫描有固定波长同步荧光法，固定能量同步荧光法，可变角同步荧光法等。电算化软件

扫描已知样品荧光激发和发射光谱时，可先根据参考波长来进行。扫描末知样品的荧光光谱，可以将发身波长先每隔一定波长（例如50nm）扫描一个激发光谱，对比不同位置的激发光谱，从最强的激发光谱中选择最大激发波长，设定该波长为激发波长，扫描发射光谱。再从新得到的发射光谱中到最大发射波长，在最大的发射波长处重新扫描激发光谱。

扫描样品激发光谱和发射光谱时，需要注意：扫描激发光谱时，激发单器扫描范围的长波端一般应小于发射波长；扫描发射光谱时，发射单器扫描范围的短波端应大于激发波长。否则在发射光谱（激发光谱）中与激发波长（发射波长）波长相同的位置会出现很强

的散射谱峰。这不是样品的荧光引起的，应当注意区分。

如果样品不是真正的溶液，或包含有不溶性颗粒物，或是固样性品，如果扫描范围较宽时，通常在发射光谱（激发光谱）中波发波长（发射波长）速数倍波长的位置也会出现较弱的散射谱峰，称为倍频峰。在分析光谱情况时也应当注意区分。对散射倍频峰或样品荧光峰，可通过适当改变激发波长来进行区分。散射倍频峰的位置也会随着激发峰的位置变化而变化。而荧光峰的位置通常是不变的。如果倍频峰对样品的测是有干扰，可使用合适的滤光片消除倍频峰。合适的消倍频峰滤光片应可以使发射光透过，阻挡激发光透过。

如果样品荧光较弱，使用高灵敏度档测定时，通常会观察到溶济的拉曼峰。也应当注意与样品荧光进行区分。拉曼峰的位置也与激发波长有关，同时也随着激发波长的变化而变化，其位置可以估算出来。

实验材料：

FITC-OVA蛋白质溶液

FITC 最大吸收光谱为：490-495nm

最大发射光谱为：520-530nm

呈黄绿荧光

实验内容：

1、FITC-OVA蛋白质，进行不同浓度、不同激发波长、固定发射波长下的数值变化。

发激波长	发射波长
480nm	525nm
485nm	525nm
490nm	525nm
495nm	525nm
500nm	525nm
505nm	525nm
510nm	525nm

将FITC-OVA样品超纯水稀释成不同浓度，吸100ul置于96孔板中，读荧光光度计值。

2、FITC-OVA蛋白质，进行不同浓度、相同激发波长、不同发射波长下的数值变化。

激发波长	发射波长
493nm	500nm
493nm	510nm
493nm	515nm
493nm	520nm
493nm	525nm
493nm	530nm
493nm	540nm

将FITC-OVA样品超纯水稀释成不同浓度，吸100ul置于96孔板中，读荧光光度计值。

3、固定激发波长、固定发射波长，FITC-OVA在不同溶液中，荧光分光光度数值比较。

激发波长	发射波长
493nm	525nm

将FITC-OVA样品超纯水稀释、用生理盐水稀释、用自来水稀释成不同浓度，

吸100ul置于96孔板中，读取荧光光度计读取的数值。

实验结果：

1、不同的激发波长、固定发射波长情况下，FITC-OVA荧光光度计测定结果：

激发波长nm							发射波长nm	样品的浓度
480	485	490	495	绉500	505	510	525	样品的浓度
							----	原液
							----	原液1：10
							----	原液1：100
							----	原液1：1000
							----	空白

2、相财的激发波、不同的发射波长情况下，FITC-OVA荧光光度计测定结果：

希克

激发波长nm	发射波长nm							样品的浓度
493	500	510	515	520	525	530	540	样品的浓度
---								原液
----								原液1：10
----								原液1：100
----								原液：1000
-----								空白